胸腺细胞渐进性凋亡对大鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响

【摘要】  目的：研究胸腺内胸腺细胞电镜结构的渐进性、增龄性凋亡等形态学改变，探讨引起脾脏淋巴细胞增殖功能变化的可能机制。方法：光镜、电镜下观察胸腺主要结构的增龄性变化，测试凋亡细胞数。脾脏淋巴细胞增殖实验，脾脏组织流式细胞仪检测细胞凋亡率。并统计学分析。结果：在光镜下观察显示随着年龄增长，胸腺皮、髓质分界不清，胸腺细胞稀疏。电镜下胸腺细胞退化萎缩，出现大量凋亡小体。胸腺细胞凋亡百分率与成年年龄正相关（P<0.05），脾脏内淋巴细胞在进入老年后才出现凋亡。成年组脾脏淋巴细胞增殖活性就开始出现明显增强（P<0.05）。结论：随着鼠龄增大，而胸腺比脾脏内淋巴细胞更易于凋亡，胸腺细胞凋亡直接或间接促进脾脏淋巴细胞增殖功能。

【关键词】  胸腺细胞；凋亡；脾脏；淋巴细胞转化；退化萎缩

    Abstract  Objective：To study the electron microscopic gradually morphologic change and apoptosis of the structual with age of  thymocytes in rat; and to explore its possible mechanism of proliferation of lymphocytes of rat’s spleens. Methods： The structure changes of the thymus were observed  by light and electron microscopic methods, testing apoptosis counts of the cells, the detection of spleens lymphocyte proliferation.Flow Cytometry Detection of Apotosis rate in Spleens was used to study the quantitatively and make  statistics analysis. Results： With age increasing, the line between cortex and medulla can’t be distinguished in the high power microscope. And thymocytes was few. Thymocyte was degenerative and involute. A great numer of apoptotic bodies were found. The thymocytes density ratio of cortex to medulla decreased is positive correlation with aging（P<0.05）.The apoptotic lymphocyte of Spleens old age take place. Effective activation of in adult group spleens are much increased（P<0.05）.Conclusion： With age increased,apoptosis  is  more easy with thymocytes  than that in spleens. Thymocytes apoptosis can directly or indirectly promote the proliferation power of spleens lymphocytes.

    Key words  Thymocytes ;Apoptosis; Spleens; lymphocyte transformation; Invotion

    在衰老过程，机体的代谢和生理功能都有不同程度的改变，近年研究发现，免疫器官是机体对内外环境的适应和反应体系，从根本上参与了机体衰老的全过程。研究免疫系统在衰老过程中的变化具有重要的理论和临床意义。因此衰老对人体免疫影响的机制和防暑措施是当前国内外医学研究的重点内容。观察动物免疫器官的变化常选胸腺、脾脏，一般观察胸腺皮质厚度，胸腺皮质增厚、皮质

    淋巴细胞增多［１］，提示机体免疫功能的提高。诸多学者用物理及化学等方法对胸腺结构及胸腺免疫功能的影响等不同领域做了相关研究。但任何研究都不能排除胸腺增龄变化对各项研究有广泛的影响［２］，本课题主要从形态学角度观察胸腺光镜、电镜结构的增龄变化，探讨免疫功能低下的形态学基础。用免疫指标的对比来探讨大鼠衰老胸腺衰老凋亡对脾脏免疫功能的影响及可能机制。

    １  材料和方法

    1.1  实验动物及分组

    SD大鼠30只，由福建医科大学实验动物研究室提供，动物合格证号：闽实动质准第002-05号。植物血球凝集素（PHA）、四甲基戊唑蓝(MTT)：由南京建成生物工程公司提供。动物分三组。幼年组：出生1周内；成年组：8周～10周龄；老年组：18月龄。每组10只，雌雄不分。正常饮水及饲料，适应性喂养。

    1.2  脾脏淋巴细胞增殖实验

    处死大鼠，无菌操作取少量脾脏组织，用生理盐水漂洗其表面血污，用眼科剪剪成肉糜状，加有1 mL PBS的小平皿内轻轻研磨分别制成脾脏单细胞悬液。将细胞液加入24孔培养板，细胞数5×106个/孔，培养板置于37 ℃，应用PHA诱导,以MTT比色分析法620 nm酶标仪测定吸收度的大小。

    1.3  流式细胞仪检测

    无菌操作研磨胸腺、脾脏组织，300目尼龙网过滤，离心，冷乙醇固定。制备脾细胞悬液，计数细胞终浓度1×106个/mL，流式细胞仪检测，计数10 000个细胞，测定细胞凋亡率。

    1.4  光镜标本的制备

    各组大鼠用戊巴比妥腹腔内注射麻醉后开胸，摘取部分胸腺组织，入10%甲醛溶液固定，按常规制成石蜡包埋块，切片机（德国Leica RM2015）以5 μm连续切片，常规苏木精-伊红（HE）染色。

    1.5  组织学观察图像分析

    光学显微镜（日本Olympus BX51T-PHD-J11）观察。进行200×和400×的显微照相，编号、采集、分析存盘。

    1.6  凋亡细胞数计算

    每张玻片随机观察200个细胞，计数凋亡细胞数。每组观察4张玻片。计算凋亡率：

    凋亡率（%）=凋亡细胞数/观察细胞数（200个）×100

    1.7  电镜标本的制备

    紧贴胸腺表面取材，取胸腺皮质切成1 mm 3小块迅速固定于2.5%戊二醛磷酸缓冲溶液，反复洗涤后用1%锇酸溶液作后固定，乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片。醋酸铀与柠檬酸铅染色，H-600型电子显微镜观察与摄片。

    1.8  统计学处理

    所有实验数据用SPSS10.0软件处理，采用单因数方差分析，两两比较用S-N-K法。以x±s进行t检验,以P<0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  胸腺组织结构

    幼年组胸腺小叶结构明显，皮质较厚，被膜下胸腺细胞密集，大小一致。位于中央的髓质呈散在的斑点状，含少量的胸腺细胞，较多的上皮性网状细胞，着色浅；胸腺小体个体小且少。皮、髓质分界清楚。成年组大鼠的胸腺皮质变薄，主要由胸腺细胞和上皮性网状细胞构成，细胞间隙变宽，髓质结构疏松，上皮性网状细胞增多，胸腺细胞数量减少。老年组胸腺脂肪、纤维增多，小叶间隔变宽；胸腺细胞体积变小，细胞间隙增大。

    2.2  胸腺电镜结构

    2.2.1  胸腺细胞分布与结构变化：幼年组胸腺细胞多呈圆形或卵圆形，被膜内侧皮质浅层细胞排列紧密，近髓质区域细胞较小，核约占细胞体积的4/5，细胞内游离核糖体较多。上皮性网状细胞体大向深部组织延伸并包绕周围的胸腺细胞（见图1）。成年组细胞均匀分布，部分胸腺细胞内内质网增生肿胀扩张呈囊泡状。散在少量凋亡细胞，核裂解成团快状，偶见部分细胞内质网肿胀扩张，呈大小不等的囊泡状（见图2）。老年组胸腺细胞间隙增宽，细胞轮廓不清；核肿胀、固缩；胞内游离核糖体、线粒体均减少。偶见胞核浓缩、边集的游离的凋亡细胞或由质膜包被的凋亡小体（见图3）。

    2.2.2  凋亡小体：幼年组皮质浅层胸腺细胞排列紧密，中部、深部胸腺细胞间隙稍宽，均不见凋亡细胞或凋亡小体。成年组被膜内侧皮质浅层、中间部胸腺细胞间隙稍宽，而与幼年组对照细胞形态结构基本上无差别，皮质深部偶见细胞核浓缩、边集的凋亡细胞。老年组的皮质周边部细胞间隙增宽，脂肪化与纤维化，中间部细胞出现部分凋亡细胞或凋亡小体；在皮质深部可见三五成群存在的形态不规则，胞核浓缩、胞质破碎的凋亡小体。2.3  脾脏淋巴细胞增殖实验结果变化

    表1中CPM结果表明，与成年组相比较，老年组有明显下降，有统计学意义(P<0.05）。其结果显著性差异(P<0.01）（见表1）。表1  大鼠脾脏淋巴细胞增殖活性的随龄变化与幼年组比较* P＜0.05；与幼年组比较** P＜0.01

    测定分析结果，成年组脾脏淋巴细胞增殖活性高于幼年组（P<0.05），老年组脾脏淋巴细胞增殖活性与幼年组比较差异显著（P<0.01）。

    2.4  流式细胞仪检测

    表2中用流式细胞仪检测的胸腺和脾脏细胞的凋亡率，测定分析结果，成年组胸腺细胞凋亡率明显高于幼年组（P<0.05）。而成年组脾脏细胞凋亡率与幼年组比较没有出现明显改变（P＞0.05）。老年组胸腺和脾脏腺细胞凋亡率与幼年组比较均差异显著（P<0.01）。表2  大鼠胸腺和脾脏细胞凋亡百分比

    3  讨论

    有关器官、组织或细胞的衰老、凋亡的研究有多种方法，其中形态学则被认为是鉴定细胞凋亡最可靠的方法［３］。本研究关于机体免疫器官形态学的增龄影响，主要利用透射电镜技术对不同年龄组的大鼠胸腺内胸腺细胞等结构进行观察，显示随着年龄的增长胸腺细胞发生一系列的凋亡形态学改变［４］。老年组的胸腺显微结构比青年组的退化更显著；电镜结构则显示细胞器发生不同程度的改变，线粒体结构的退化最显著，于是生物氧化及能量代谢受阻，导致细胞功能障碍［５］，出现胸腺细胞结构萎缩或凋亡。而细胞凋亡初期胞质无明显改变，细胞表面突出的凋亡小体仍由胞质膜包绕［５］，表明核在细胞凋亡过程中的主导作用［７］。另胸腺细胞在发育过程中，常有90%左右的小淋巴细胞发生凋亡；加上衰老时骨髓中的原始T淋巴细胞迁移到胸腺的能力下降，于是胸腺细胞数大量减少。而胸腺组织的脂肪侵润也是导致胸腺萎缩的另一个重要原因［６］。以上认为是导致胸腺萎缩退化的主要机制。另实验结果显示，随年龄增长，胸腺上皮细胞胞质内与分泌激素有关的线粒体、粗面内质网、高尔基复合体等膜被囊泡结构呈明显的退化，即胸腺素或细胞因子的分泌能力受到抑制，严重破坏了胸腺细胞发育依赖成熟相互依赖生存的胸腺微环境，导致胸腺细胞增殖与分化障碍，细胞数量减少、细胞凋亡发生率增大，及胸腺进一步萎缩退化［７］。

    胸腺作为机体中枢免疫器官，是T淋巴细胞发育成熟的器官；脾脏作为外周免疫器官，是成熟T淋巴细胞和B淋巴细胞定居的部位。在衰老过程胸腺皮质内胸腺细胞幼稚，逐渐向髓质迁移，到髓质成为近于成熟或成熟的T淋巴细胞，成熟的胸腺细胞迁移到脾脏。而胸腺细胞凋亡主要发生在皮髓质交界处［８］。一般观察胸腺皮质增厚、皮质淋巴细胞增多，提示机体免疫功能的提高［９］，而淋巴细胞增殖活性是检测细胞免疫功能常用的体外实验方法。成年组大鼠胸腺细胞的凋亡率与幼年组比较明显升高，有统计学意义(P<0.05)。胸腺细胞凋亡与成年后年龄成正相关关系，脾脏细胞仅在老年组出现显著高于幼年组的凋亡，成年后对脾脏细胞无明显作用，结果提示衰老对胸腺细胞凋亡影响较早。老年后T细胞在脾脏、胸腺中的比例变化趋势一致，胸腺和脾脏细胞凋亡的高峰出现在老年期，说明免疫器官的细胞凋亡存在着时间-效应关系。衰老过程胸腺细胞经历发育、成熟、和迁徙的过程，胸腺细胞凋亡与其在胸腺内细胞发育成熟期的增殖周期的进程紊乱有关。使得迁徙到外周活化的T细胞减少。机体在一定程度上通过免疫调节诱导某些超敏感的前T细胞凋亡从而刺激T细胞增殖与激活，促进T细胞激活与增殖，减少胸腺细胞凋亡［１０］。

    成年后脾脏在胸腺退化萎缩后出现淋巴细胞增殖能力增强，脾脏淋巴细胞增殖活性高于幼年组。而衰老通过相同的机制作用于脾脏细胞，亦可引起脾脏内淋巴细胞的生长阻滞，直接诱导外周T细胞凋亡等。由于大部分脾细胞是外周成熟的T细胞，对衰老不如未成熟的胸腺细胞敏感，故成年后脾脏细胞凋亡的程度没有胸腺明显，结果显示脾脏淋巴细胞增殖活性依然很强。另少量免疫细胞迁徙到淋巴结、脾脏等外周器官后，受到自身抗原、细菌、真菌、寄生虫甚至免疫抑制剂等许多外源性抗原的刺激而分化为外周T细胞发挥抗原非特异性的免疫抑制作用［１１］。随年龄增长，免疫系统内免疫细胞的生长状况在一定水平上反映出衰老对机体免疫器官、细胞的损伤程度［１２］。有学者认为衰老过程诱导脾脏T细胞凋亡而削弱机体免疫机能是因为衰老导致细胞形态的改变从而影响细胞的功能［１３］。另衰老导致免疫抑制过程还可能通过神经递质、激素以及免疫活性物质的参与和调控其他途径对免疫系统施加影响［１４］，衰老是否直接诱导外周T细胞凋亡、脾脏在胸腺退化萎缩后代偿性出现淋巴细胞增殖能力增强等问题仍需进一步的研究。

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