琐琐葡萄多糖对大鼠体外免疫性肝损伤保护作用的研究

【摘要】 目的研究琐琐葡萄多糖（VVP）在体外对大鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法采用热水提取、乙醇沉淀，Sevage法除蛋白、透析分离纯化提取VVP，苯酚硫酸法测定多糖含量。采用BCG整体致敏，LPS离体攻击法建立大鼠原代肝细胞免疫损伤模型，取细胞上清液测定其ALT，AST活性和NO含量。结果琐琐葡萄中多糖含量为8.19％；VVP 5，20，80μg/ml均可程度不同地使BCG+LPS损伤后升高的大鼠肝细胞上清ALT，AST活性和NO含量明显下降，其作用与阳性对照药物甘立欣（Grz）相似。结论VVP在体外对大鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用。

【关键词】 琐琐葡萄； 多糖； 肝细胞； 免疫性肝损伤

Abstract：ObjectiveTo study the effect of polysaccharide isolated form Vitis viniferal on immunological liver injury model in vitro.MethodsVitis amurensis Polysaccharide was obtained by extracting with water, precipitation with 95% ethanol, clearing protein with the sevage assay, and dialyzing and phenol - sulphate colorimetry was used to determine its content. The immunological hepatotoxicity model was induced by Bacillus Calmette Guerin (BCG) plus lipopolysaccharides (LPS) in vitro. The supernatant of cells after 3～24 h incubation with VVP were taken for the estimation of ALT, AST and NO respectively. ResultsThe content of polysaccharide in Vitis amurensis was 8.19％. Elevated ALT, AST activities and NO level were decreased after treatment with VVP (5，20，80 μg/ml) in different doses. The effects of VVP mentioned above were similar to those of the standard drug, Dinmmonium Glycyrrhizinate (Grz) . ConclusionVitis viniferal polysaccharide shows significant protective effects against immunological liver damage induced by BCG plus LPS in vitro.

Key words：vitis viniferal; Polysaccharide; Hepatocyte; Immunological liver injury

琐琐葡萄为葡萄科葡萄属植物琐琐葡萄Vitis viniferal L.的成熟果实，主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地，是维吾尔医习用的一种药食兼用植物，药用果实，具有健脾胃、理肺、生津、养血等作用。维医用于治疗脾胃不和、神志不安等，民间用于小儿麻疹、肝炎等症［1］。琐琐葡萄中除含有大量的葡萄糖、果糖、维生素、氨基酸等营养成分外，还有鞣质类、黄酮、萜类、多糖等多种生物活性物质［2～4］。研究表明多糖（polysaccharides）具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗衰老、抗辐射等多方面的药理作用［5］，是近年来天然药物研究的热点课题之一。为探讨多糖与琐琐葡萄抗病毒免疫调节活性的相互关系，本研究采用热水提取、乙醇沉淀，Sevage法除蛋白、透析分离纯化提取了琐琐葡萄多糖（VVP），苯酚硫酸法测定多糖含量，并采用BCG整体致敏，LPS离体攻击法建立大鼠原代肝细胞免疫损伤模型，探讨了VVP在体外对大鼠免疫性肝损伤的保护作用。

1 器材

1.1 动物SD大鼠，雄性，体重（200±20）g，新疆医科大学实验动物中心提供（SPF级，动物使用许可证号：SYXK［新］2003-0001）。

1.2 药材 琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维药市场，经专家鉴定为Vitis viniferal L.的果实。

1.3 仪器与试剂 UV2501PC型双光束紫外分光光度计（日本岛津）；SaBa18 AMS全自动生化分析仪（Roma-Italy）；Forma二氧化碳培养箱；XD 711型酶标仪（上海迅达医疗器械有限公司）；DZ K88-A型电热恒温真空干燥箱(上海医疗器械七厂)；CQ-50型超声波清洗器(上海超声波仪器厂) ；METTLER TOLEDO AB104-N型分析天平(Mettler-Toledo Instr.shanghai Ltd)。甘立欣（Grz，江苏正大天晴药业股份有限公司，批号060808）；Ⅳ型胶原酶、LPS（E coli 0555:B5）（Sigma公司）；DMEM培养基（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号061205）；卡介苗（BCG，上海生物制品检定所，批号0601001）；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司），N-萘基-乙烯二胺、对氨基苯磺酰胺（Fluka进口分装）。其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 VVP的提取及含量测定 琐琐葡萄药材300 g，粉碎，过40目筛，加10倍体积的水回流提取3次，3 h/次，提取液合并后减压浓缩至适量，再加入5倍体积的 95% 乙醇，静置过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，置60 ℃真空干燥箱中干燥，得粗多糖。将粗多糖溶于水，以Sevage法除蛋白，透析，透析液中加入5倍体积的95%乙醇，静置过夜，抽滤，所得沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤数次，置60 ℃真空干燥箱中干燥，即得精制多糖。以半乳糖为对照品，采用苯酚-硫酸法［6］测定琐琐葡萄中多糖的含量为8.19％。

2.2 大鼠原代肝细胞培养方法［7］采用两步灌流法取大鼠原代肝细胞进行培养。取SD雄性大鼠6只，随机分为两组，模型组经尾静脉注射BCG 8 mg/只致敏，正常组经尾静脉注射等体积生理盐水。第12天分别取正常和BCG致敏的大鼠，腹腔麻醉，酒精消毒后开腹，分离肝门静脉并行门静脉插管，以37℃无钙灌流液灌流肝脏，迅速剪断下腔静脉，作在位灌流5 min，边灌流边切断肝与周围组织的联系，将肝移置无菌托盘内继续灌流。冲尽残血后，换为37℃ Ⅳ型胶原酶灌流液循环灌流10 min。取出肝脏转移至超净工作台中进行无菌操作。

撕去肝包膜后将肝在培养液中轻轻振摇，散落肝细胞，收集细胞悬液，500 r/min，离心3 min，弃上清液，向沉淀中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液同条件重复清洗两次，最后用DMEM培养液重悬细胞。用0.4%等张台朌蓝溶液染色，计算细胞活率，细胞活率在90%以上者可用于实验。 将分离的正常或BCG致敏的大鼠肝细胞悬液用DMEM培养液稀释成2.5×105个细胞/ml，接种于24孔培养板中，每孔加入1 ml。于37℃，5%CO2孵箱中培养16 h后，取出，弃培养上清液，正常组换以不含血清的DMEM培养液1 ml，BCG致敏大鼠的肝细胞用10 μg/ml的LPS攻击的同时，分别加入以不含血清的DMEM培养液配制的各浓度阳性药物或VVP受试药物溶液1 ml进行防护，继续培养，每组平行6复孔。分别于3，6，12和24 h时间点收集以上各组细胞上清液，置-70℃冰箱保存，待测。

2.3 指标检测AST，ALT采用连续监测法测定；NO采用Griss法［8］测定。

2.4 数据处理 使用SPSS12.0软件包，采用方差分析ANOVA，LSR进行统计分析处理，结果以±s表示。

3 结果

3.1 VVP对BCG+LPS诱导的大鼠原代培养肝细胞上清液中AST和ALT活性的影响表1～2结果显示，正常大鼠肝细胞上清液中AST和ALT活力随时间的延长变化不大；与正常对照组比较，BCG+LPS损伤后模型组大鼠肝细胞上清液中AST和ALT活力随时间的延长逐步明显升高，在24 h虽有所下降，但仍显著高于正常对照组（P＜0.01）。除低、中剂量组在3 h时间点未明显抑制AST活性外，VVP各剂量组在6，12，24 h各时间点均可不同程度地抑制AST和ALT活性（P＜0.01或P＜0.05），其降酶作用与阳性对照药物Grz相似，并存在明显的剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，降酶活性逐步增强。 表1 VVP对大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤后细胞上清液中AST活性的影响与对照组比较，○P<0.01; 与BCG+LPS组比较，●P<0.01; 与低剂量组比较，△P<0.01,▲P<0.05; 与中剂量组比较，□P<0.01；n=6表2 VVP对大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤后细胞上清液中ALT活性的影响与对照组比较，○P<0.01; 与BCG+LPS组比较，●P<0.01; 与低剂量组比较，△P<0.01,▲P<0.05; 与中剂量组比较，□P<0.01, ■P<0.05；n=6

3.2 VVP对BCG+LPS诱导的大鼠原代培养肝细胞上清液中NO含量的影响图1结果显示，正常大鼠肝细胞上清液中NO的含量随时间的延长基本保持平稳；与正常对照组比较，BCG+LPS损伤后模型组大鼠肝细胞上清液中NO的含量随时间的延长逐步明显升高，在24 h虽有所下降，但仍显著高于正常对照组（P＜0.01）。除低、中剂量组在3 h时间点未明显降低NO含量外，VVP各剂量组在其它各时间点均可不同程度地使升高的NO含量下降，并存在明显的剂量依赖关系。

4 讨论

多糖广泛分布于多种生物体中，尤其是动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是构成生命的分子基础之一［5］，也是一种重要的信号或信息分子的受体，它参与分子识别、细胞粘附及防御等生理过程的调节活动，具有抗病毒、免疫促进、抗肿瘤及降血糖等作用。因其独特的药理活性和低毒效应，在临床应用中具有极大的潜力。目前，对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。

本实验研究结果证实， VVP各剂量组在6，12和24 h均可不同程度地降低由BCG+LPS诱导引起的原代培养大鼠肝细胞上清

与对照组比较，○P<0.01;与BCG+LPS组比较，●P<0.01,△P<0.05; 与低剂量组比较，▲P<0.01,□P<0.05; 与中剂量组比较，■P<0.05 细胞上清NO含量的影响（±s，n=6）

液中转氨酶水平的升高，提示VVP对免疫性肝损伤具有较好的降酶作用。NO 是许多肝脏疾病中重要的炎性介质之一。据报道，肝细胞在体外可经特异性细胞因子及LPS协同诱导，持续产生大量的NO，介导多种病理生理效应, 包括肝细胞毒性效应［8］。本实验发现在BCG和LPS诱发原代培养大鼠肝细胞损伤致AST和ALT升高的同时，NO含量也显著高于正常对照组，与文献报道［9］一致，表明NO可能介导了肝细胞毒性效应，而VVP各剂量组在不同时间点均可不同程度地使NO生成量减少，提示VVP可能由于抑制了诱生型NO的生成而抑制了AST和ALT的活力，显示出较好的护肝降酶作用。

通过本研究发现琐琐葡萄中多糖含量为8.19%，且其对BCG+LPS诱导引起的原代培养大鼠免疫性肝细胞损伤具有显著的保护作用，提示VVP作为天然生物活性免疫调节剂具有一定的开发应用价值。而多糖作为琐琐葡萄的主要活性成分，其免疫调节作用机制还有待于进一步开展深入研究，为探明维药琐琐葡萄发挥药理作用的物质基础及其可能的作用机制提供理论依据，也为充分利用新疆葡萄的资源优势，开发出安全、价廉、有效的民族新药提供实验依据。

【参考文献】
［1］ 新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准（上册）［S］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1993：347.

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［4］ Pace-Asciak CR, Hahn SE, Diamandis EP, et al. The red wine phenolics trans resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: implications for protection against coronary heart disease［J］. Clin Chim Acta,1995,235:207.

［5］ 邓小云，丁登峰，戴美红，等.植物多糖药理作用研究进展［J］. 中医药导报，2006，12(9)：86.

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