异株荨麻茎叶中黄酮类化合物含量测定方法的研究

【摘要】 　　目的研究异株荨麻茎叶中黄酮类化合物的测定方法。方法分别采用Al（NO3）3络合分光光度法和HPLC法测定异株荨麻茎叶中黄酮类化合物的含量，并对测定结果进行比较；同时以黄酮类化合物的含量为指标，优选出了超声波辅助法提取异株荨麻茎叶中黄酮类化合物的最佳条件。结果超声波辅助法的最佳提取条件：体积分数为80%的乙醇溶液、料液比为1∶30，提取温度为60℃；HPLC法同时测定异株荨麻中芦丁和槲皮素的高效液相色谱条件：色谱柱选用DiamosnilTM钻石C18（250 mm×4.6 mm,5 μm），柱温25℃，流动相为甲醇：0.4%磷酸=55∶45，流速1.0 ml/min，检测波长370 nm。结论Al（NO3）3络合分光光度法操作方便，简单，快速；HPLC法可以同时准确地测定出样品中不同黄酮类化合物的含量，精确性和灵敏度高。两种方法测定的总黄酮含量相差甚微，应根据不同的测定目的，选择适当的测定方法。

【关键词】 异株荨麻 黄酮类化合物 高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo study on determination methods of the contents of flavonoids in stems and leaves of Urtica dioica L..MethodsThe contents of flavonoids in the extracts from Urical dioica L. stems and leaves were determined and compared by Al(NO3)3 colorimetry and HPLC. The method with ultrasonic wave was applied to extract flavonoids from the leaves and stems of Urtica dioical L.. With the contents of flavonoids as the index, the best extraction conditions were selected out. Results The best extraction conditions were as follows:soaking the raw material with ethanol(80%, v/v)-water solution (1∶30) at 60℃. HPLC method was established for determination of rutin and quercetin in the sample of Urtica dioica L. Adiamonsil TM C18 (25 mm×4.6 mm,5 μm by volume) containing 0.4% phosphoric acid used as mobile phase at flow rate of 1 ml·min-1 for gradient elution. UV detector was set at 370 nm, and the column temperature was set at 25 ℃. ConclusionThe method of Al(NO3)3 colorimetry is easy and quick. The method of HPLC is accurate and sensitive. It can simultaneously and exactly determine the contents of different flavonoids. The results show that the contents of total flavonoids in Urtica dioica L. by the two methods are extremely equal. For different study objective, proper method can be chosen.

　　Key words：Urtica dioica L.； Flavonoids； HPLC

　　异株荨麻Urtica dioica L.为荨麻属Urtica linn.的一种多年生草本植物，在我国又叫大荨麻，全草或根均可入药，为一常用的民族药和民间药,广泛用于治疗风湿、尿石症、糖尿病、贫血、哮喘、心绞痛、前列腺炎、前列腺增生等［1］及一些老年性疾病，疗效显著。现代医学药物研究认为，异株荨麻具有抗风湿、抗过敏、增强人体免疫力、美容及保健等多种作用［2］。其广泛分布在欧洲、美洲、非洲和亚洲的温带地区，在我国云南、西藏、青海和新疆等地也有野生种分布。对于异株荨麻的研究和开发利用，国外较为成熟，而目前国内的研究还处于起步阶段，一般只在民间应用。现有研究已从大荨麻的醇提物和水提物中分离出约90种化合物，包括甘油硬脂酸酯、三萜酸、香豆素、简单酚、木脂素、神经酰胺及羟基脂肪酸、有机酸、多糖、植物凝集素等［3］。其活性成分主要有黄酮类、有机酸类、酚类、苯丙素类、甾醇、蛋白质、多糖等。

　　相关药理和临床实验证实，黄酮类化合物作为药用植物的主要活性成分之一，具有广泛的药理功能，如不少治疗冠心病有效的中草药或活血化瘀类中药中均含有黄酮类化合物，芦丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、葛根素(puerarin)、人工合成的立可定(recordin)等均有明显的扩冠作用，并已被用于临床［4，5］；还有许多黄酮类化合物被证明有抗癌和抗HIV病毒活性［6，7］。由于该类化合物具有多种多样的生物活性和药理功能，且毒性较低，引起了人们的重视，已经成为当今社会研究和开发利用的热点，是寻找有开发应用前景的先导化合物和生物活性成分的源泉。

　　目前分析黄酮类化合物的方法主要有: 分光光度法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、极谱法和色谱-质谱联用等［8］。本文分别用分光光度法、高效液相色谱法对异株荨麻地上部分的黄酮类化合物进行了测定，并比较分析了两种测定方法的结果，为测定异株荨麻中黄酮类化合物的含量奠定了基础，同时也为异株荨麻的质量控制提供了科学依据。

　　1 仪器与试剂

　　1.1 仪器

　　Spectrum752型紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SENCOR-201型旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)； Anke TDL-5型离心机(飞鸽牌)；FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Agilent 1100 型高效液相色谱仪；索氏提取器。

　　1.2 试剂

　　流动相所用甲醇为色谱醇（美国 Fisher Scientific）；水为娃哈哈纯净水,用时均过微孔滤膜(0.45μm)；样品提取所用乙醇和氯仿均为分析醇(北京化工厂)；槲皮素和芦丁对照品均购自中国药品生物制品检定所。

　　1.3 材料

　　样品采于北京林业大学西山林场，在105℃杀青15 min后自然晾干，经中草药粉碎机粉碎，过80目筛后，于干燥器中保存、备用。

　　2 方法与结果

　　2.1 样品脱脂处理取样品（异株荨麻）粉末适量，于100 ml具塞三角瓶中,加60 ml氯仿溶液，摇匀，在45℃下，超声处理30 min，取出趁热进行离心（3 000 r/min,5 min)，除去上层液后再加入60 ml氯仿溶液，在同样的条件下重复脱脂3次，将脱脂后的样品粉末自然风干。

　　2.2 分光光度法

　　2.2.1 提取条件的选择提取溶剂的选择：精确称取脱脂后的样品1 g于100 ml具塞三角瓶中，分别加入70％，80％，90％的乙醇溶液30 ml和1.5 N的盐酸10 ml，摇匀，称重；在60℃、100Hz下,超声处理30 min，取出冷却至室温，称重，补足失重,进行离心(3 000 r/min,5 min)，取上清液于三角瓶中，下层沉淀重新分别加入70％，80％，90％的乙醇溶液30 ml和1.5 N的盐酸10 ml，重复提取3次，合并上清液，在60℃下浓缩于10 ml容量瓶中，分别用70％，80％，90％的乙醇溶液定容至刻度，用分光光度法测定黄酮含量见表1。结果表明，80％的乙醇溶液提取效率最高。表 1 乙醇体积分数对提取率的影响（略）

　　提取料液比的选择：精确称取脱脂后的样品1 g于100 ml具塞三角瓶中，分别加入80％的乙醇溶液20，30，40 ml和1.5N的盐酸10ml，摇匀、称重；在60℃，100 Hz下,超声处理30 min，取出冷却至室温，称重、补足失重、离心(3 000 r/min,5 min),取上清液于三角瓶中，下层沉淀重新分别加入80％的乙醇溶液20，30，40 ml和1.5 N的盐酸10 ml,重复提取3次，合并上清液。在60℃下浓缩于10 ml容量瓶中,用80％的乙醇溶液定容至刻度，用分光光度法测定黄酮含量见表2。结果表明，料液比为1∶30时，提取效率最高。 表 2 料液比对提取效率的影响（略）
　　
　　提取温度的选择： 精确称取脱脂后的样品1 g于100 ml具塞三角瓶中, 加80%的乙醇溶液30 ml和1.5 N的盐酸10 ml，摇匀、称重；分别在40℃，50℃，60℃的温度和100 Hz下，超声处理30 min，取出冷却至室温，称重、补足失重、离心(3 000 r/min,5 min)，取上清液于三角瓶中,下层沉淀重新加入80%的乙醇溶液30 ml和1.5N的盐酸10 ml，重复提取3次，合并上清液。在60℃下浓缩于10 ml容量瓶中，用80%的乙醇溶液定容至刻度，测定黄酮含量见表3。结果表明，黄酮提取效率随温度的升高而提高，因为随着温度的升高，分子的运动速度加快，有效成分渗透和溶解速度加快，黄酮类化合物溶出度自然会加大，但当温度过高时会造成黄酮类化合物的化学结构变化，因此当温度超过70℃时，黄酮提取效率有下降趋势，同时杂质的溶出量也大量增加，给后续的操作带来不便，还会造成溶剂损失［9］。综合考虑认为提取温度以60℃为宜。表3 提取温度对提取效率的影响（略）

　　2.2.2 样品溶液的制备精确称取脱脂后的样品1 g于100 ml具塞三角瓶中，加80%的乙醇溶液30 ml和1.5 N的盐酸10 ml，摇匀，称重；在60℃，100 Hz下，超声处理30 min，取出冷却至室温，称重，补足失重，离心(3 000 r/min,5 min)，取上清液于三角瓶中，下层沉淀重新加入80%的乙醇溶液30 ml和1.5N的盐酸10 ml，重复提取3次，合并上清液，在60℃下浓缩于10 ml容量瓶中，用80%的乙醇溶液定容至刻度，作为供试品溶液。

　　2.2.3 标准曲线的绘制精确称取芦丁5.6 mg(120℃烘至恒重)置于50 ml容量中，加60％的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得0.103 mg/ml的标准液。准确地吸取此溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别置于10 ml具塞试管中，各加30％的乙醇至5 ml，再加入5%的NaNO2 溶液0.3 ml,摇匀、放置6 min，加入10％的Al（NO3）3 溶液0.3 ml，摇匀、络合6 min,加入4%的NaOH溶液4 ml，摇匀、显色15 min，最后用水稀释至刻度，摇匀、放置15～20 min, 在波长510 nm处测定溶液的吸光度，并以吸光度(A)作纵坐标， 溶液浓度(C)作横坐标绘制标准曲线（见图1）。　结果表明，吸光度与浓度呈良好的线性关系，经最小二乘法回归处理得到方程：A = 15.274C + 0.007 8，R2 = 0.999 1。

　　2.2.4 样品的测定准确移取供测样品溶液0.5 ml于10 ml具塞试管中，用80％的乙醇溶液稀释到5 ml，按照标准曲线绘制项下方法操作，测定吸光度，由回归方程求出各样品液中总黄酮浓度，然后计算含量。结果见表4。表 4 分光光度法测定样品总黄酮含量 （略）

　　2.2.5 重复性实验取同一批前处理过的异株荨麻粉末 1 g，在连续5天内用“样品溶液的制备”项下的提取方法进行提取, 再按“样品的测定”项进行测定。结果：总黄酮平均含量为7.569 mg/g，RSD=8.47% ，表明此方法重复性良好。

　　2.3 高效液相色谱法

　　2.3.1 样品提取方法的选择样品的前处理采用了直接提取与酸水解两种方法，经HPLC 测定发现，酸水解法的提取效果明显好于直接提取法。从色谱图上可以看出，两种提取方法所测成分峰面积相差1.5～2.5 倍；其余试剂峰或未知峰的干扰程度不同，均导致测定结果的差异。因此 ，我们认为采用酸水解法处理样品较好。

　　2.3.2 流动相和检测波长的选择选择流动相时，适当增加甲醇量可使样品在与其它成分分离的前提下出峰敏锐，减少拖尾。本实验比较了不同比例的甲醇-磷酸水流动相,分别为25∶75，30∶70，40∶60，50∶50，55∶45，60∶40。结果表明以甲醇∶磷酸水＝55∶45的比例为流动相，出峰敏锐而且比较对称，分离效果好。在选定的流动相条件下，芦丁、槲皮素两种黄酮苷元的UV 吸收曲线表明,其最大吸收波长略有差异，但在370 nm 处均有较强的吸收，为兼顾两者，选择370 nm 为检测波长。

　　2.3.3 流动相pH值的选择流动相中加入一定量的酸对黄酮成分的色谱行为影响很大。加入适量的酸可改善黄酮色谱峰的拖尾现象，使峰形对称。经实验，流动相的pH值对槲皮素、芦丁的峰形有较大影响。随着pH值的升高，峰高降低，影响测定灵敏度；峰宽先变窄后又变宽，影响峰形；但是峰面积几乎相差不大。 又由于流动相pH值过低，影响色谱柱使用寿命。在不影响样品分离的情况下，综合分析认为，采用0.4%的磷酸作为流动相，即可减少磷酸对色谱柱的损伤，又可使出峰敏锐。因此，本实验选用0.4%的磷酸作为流动相。

　　2.3.4 色谱条件色谱柱选用DiamonsilTM 钻石 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温 25℃；检测波长370 nm ；流动相为甲醇：0.4%磷酸=55∶45；流速1.0 ml/min；进样量20 μl。

　　2.3.5 标准液配制

　　槲皮素标准液：精确称取槲皮素标准品5.4 mg，置于100 ml 棕色容量瓶中，用少量色谱甲醇摇匀溶解，再定容至刻度线，即得52.54 μg/ml的标准液浓度。

　　芦丁标准液：精确称取芦丁标准品5.7 mg，置于100 ml 棕色容量瓶中，用少量色谱甲醇摇匀溶解，再定容至刻度线，即得52.27 μg/ml的标准液浓度。

　　混合标准溶液的制备:分别移取上述两种标准液各35 ml于100 ml容量瓶中，用力摇晃，使其混合均匀，即得混合标准液。

　　2.3.6 标准曲线绘制用微量进样器分别进样混合标准溶液2，4，6，8，10μl 于高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积(A)作纵坐标，溶液浓度(C)作横坐标绘制标准曲线，见图2～3。结果表明：峰面积与浓度呈良好的线性关系，经最小二乘法回归处理得：芦丁线性方程为A = 2 110.1C-16.331，R2 = 0.999 6；槲皮素线性方程A=4 237.8C-31.849，R2=0.997 5。

2.3.7 精密度实验取同一混合标准液，按上述色谱条件，连续进样5次测定其峰面积，计算芦丁、槲皮素的峰面积RSD分别为2.95% 和3.35%,表明精密度良好。

　　2.3.8 样品测定移取样品溶液适量，用0.45 μm的过滤器过滤，用取样器取20 μl过滤液上高效液相色谱仪，按“色谱条件”项下的条件测定，结果见表5，芦丁的平均含量为336.738 μg/g，槲皮素的平均含量为8.467 μg/g。表5 HPLC测定样品中芦丁和槲皮素的含量（略）

　　2.3.9 重复性实验取同一批异株荨麻，在连续5 d内用“样品溶液的制备”项下的提取方法进行提取，按上述色谱条件进样测定，结果表明该方法的重复性较好。芦丁的平均含量为 331.727 μg/g , RED＝3.080%；槲皮素的平均含量为 8.402 μg/g，RSD＝4.875% 。

　　2.3.10 稳定性实验取同一供测样品，分别在不同时间2，4，6，8，10 h测定，结果表明样品溶液中的芦丁在10 h内稳定, 芦丁的平均含量为292.972μg/g，RSD分别为 5.743% ；槲皮素在6 h内稳定， 6 h后出现双峰，槲皮素的平均含量为7.466 μg/g，RSD为 1.468％。

　　2.3.11 总黄酮含量的计算从总结植物材料中黄酮类化合物测定结果的统计处理中得出，如以槲皮素为标准品，则黄酮苷的含量换算可统一采用2.51［10］这一换算系数。样品经HPLC 分析，测得样品中主要成分为槲皮素、芦丁的峰面积A1、A2 ，由槲皮素标准曲线、平均换算系数(2. 51) 及回归方程,可得黄酮苷含量，计算公式如下：

　　CT % = ［( A1 + A2 + 31.849 ) ×2. 51 × 10 × 10-3］/( 4 237.8×ms )×100 %

　　其中4237.8 为槲皮素标准曲线斜率；31.849为槲皮素标准曲线截距；10 为样品溶液体积(ml)；ms 为样品质量(g)。结果见表6，测得样品中总黄酮的平均含量为 8.771 mg/g。表6 HPLC测定样品中总黄酮含量（略）

　　3 小结

　　通过超声波辅助法对异株荨麻地上部分黄酮l类化合物的提取条件进行了选择，结果表明，体积分数为80％的乙醇溶液、料液比为1∶30、提取温度为60℃的条件下，提取效率最高。

　　络合-分光光度法可以避免醇溶性的绿原酸等物质的干扰，用Al(NO3)3络合分光光度法测定异株荨麻地上部分总黄酮的含量，操作方便，简单，快速，重复性好。

　　本研究筛选出用HPLC法测定异株荨麻中黄酮化合物的色谱条件为：柱温 25℃；检测波长370 nm；流动相为甲醇∶0.4%磷酸=55∶45； 流速1.0 ml/min ；进样量20 μl。HPLC法是国家标准规定的测定黄酮含量的方法，可以准确地测定出样品中不同的黄酮类化合物单体的含量，精确性和灵敏度高，也可以通过计算得到所测样品中总黄酮的含量，但测定过程相对繁琐，也易受仪器条件和环境条件的限制。

　　从两种方法测定的结果来看，所测定的总黄酮含量相差甚微，因此，应根据不同的测定指标，选择适当的测定方法。

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