中药清除羟自由基实验的改良

【摘要】 　　目的对邻二氮菲-Fe2+氧化法进行改良，使其在用于自由基清除剂筛选时更为有效和更为敏感。方法在不同的pH环境、不同的保温时间及不同的测定波长条件下进行对比实验。结果邻二氮菲-Fe2+络合物在pH 4.5的环境下及510 nm的测定波长时有较大的吸光度，30 min的保温时间使各管有较大并较为稳定的吸光度。结论通过对邻二氮菲- Fe2+氧化法的实验改良能提高该方法筛选自由基清除剂的灵敏度。

【关键词】 自由基清除剂； 邻二氮菲； 羟自由基

　　Abstract：ObjectiveThe improvement can be carried out to the oxidation of phenathroline-Fe2+ in order to be effective and more sensitive in screening the free radical scavenger.MethodsMaking experiments by comparing the conditions of different pH, heat preservations and various wavelengh.ResultsThe complex of phenathroline-Fe2+ had great absorbance with 510 nm wavelength in the environment of pH4.5, and the absorbance was larger and more stable after the 30 min heat preservation.ConclusionThe improvement can increase the sensibility for sereening the free radical scavenger.

　　Key words：Free radical scavenger; Phenathroline; Hydroxy radical

机体在代谢过程中产生多种自由基，包括超氧阴离子自由基（O-2·）、羟自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等，其中以·OH化学性质最活泼。一定数量的氧自由基可为机体所用，但过多的氧自由基将作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病［1～4］。因此，自由基清除剂的合成及寻找成为当前医药研究的主要方向之一，而中药的天然、丰富及低毒更受人们的青睐。目前人们测定自由基清除剂清除羟自由基的方法有很多，其中邻二氮菲- Fe2+氧化法操作简单，设备要求不高，易于推广和应用。本实验对该方法进行了若干改良。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂维生素C（郑州羚锐制药有限公司生产）、邻二氮菲（天津市科密欧化学试剂有限公司生产，分析纯）、硫酸亚铁铵（广东光华化学厂有限公司生产，分析纯）、过氧化氢（广东汕头市西陇化工厂生产，分析纯）、磷酸二氢钾（上海市国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇和氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司生产，分析纯）。

　　1.2 仪器752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产），DK-600S三用恒温水浴箱（上海精密实验设备有限公司生产）。

　　1.3 方法以维生素C作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH。H2O2/Fe2+体系产生的·OH将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+对536 nm波长的最大吸收减弱，A536明显降低。当反应体系中存在·OH清除剂时，此氧化过程受抑制，A536则降低不明显，并可通过A536值比较·OH清除剂的清除能力［5］。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环境由pH 7.4改为pH 4.5的酸性环境；二是将37℃保温时间由60 min改为30 min；三是测定吸光度的波长由536 nm改为510 nm。实验过程中分别在pH 7.4的磷酸缓冲液及pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温5～60 min的时间范围内、536 nm和510 nm波长分别测定吸光度，比较两种pH条件下吸光度的差异。反应中依次加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素C、Fe2+及H2O2为加药管；不加维生素C为氧化管；不加维生素C及H2O2为对照管。

　　1.4 统计学处理组间采用t检验，数据以±s表示。　2 结果

　　2.1 不同测定波长及不同pH环境下的比较从表1可以看出，邻二氮菲-Fe2+络合物的最大吸收波长为510 nm，而最佳酸碱环境为pH 4.5。表1 不同测定波长及不同pH环境下的比较(略）

　　2.2 不同保温时间及不同pH环境下的比较图1显示了pH 7.4时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于15 min时达高峰，随后缓慢下降；而加药管和氧化管吸光度一开始便呈现急剧下降的趋势。图2显示了pH 4.5时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于30 min时达高峰，此后处于基本稳定状态；加药管和氧化管吸光度均于30 min后才出现较明显的下降。

　　2.3 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较从表2可以看出，随着保温时间的延长，各管之间的ΔA逐渐加大，但pH 4.5时的ΔA加药管-氧化管，在30 min时最大，此后较为稳定。表2 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较（略）

　　3 讨论

实验表明，邻二氮菲-Fe2+络合物在酸性条件下（pH 4.5）比较稳定，有较高的吸光度，并且最大吸收波长为510nm。而保温时间也是实验中的一个重要环节，保温到某一时间时，各管的吸光度较大，同时各管之间的吸光度变化值（ΔA）也较大，有利于自由基清除剂的甑选。从实验中观察到，在pH 4.5的条件下，对照管保温到30 min有最大的吸收峰，加药管也有较大的吸光度，使加药管与氧化管之间ΔA（ΔA加药管-氧化管）达到最大，该值更能说明自由基清除剂的作用强弱，是判断自由基清除剂的重要指标，并且还能反映该方法的灵敏度。而在pH 7.4时，加药管和氧化管一开始便呈现急剧下降的趋势，虽然两管吸光度有所差异，但ΔA加药管-氧化管较pH 4.5时要小得多，不具有说服力，也降低了反应的灵敏度。综上所述，采用邻二氮菲- Fe2+氧化法衡量自由基清除剂的作用时，最佳反应条件为pH 4.5，测定波长为510 nm，37℃保温时间为30 min。

【参考文献】
　　［1］Limoli CL,Kaplan MI.Attenuation of radiation-induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation［J］.Free Radic.Biol.Med.2001,31(1):10.

　　［2］Valko M, Izakovic M. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence［J］. Mol Cell Biochem. 2004,266(1-2):37.

　　［3］Yamamoto H,Watanabe T.In vivo evidence for accelerated generation of hydroxyl radicals in liver of long-evans cinnamon (LEC) rats with acute hepatitis［J］. Free Radic.Biol.Med.2001,30(5):547.

　　［4］赵克然,杨毅军,曹道俊.氧自由基与临床［M］. 北京:中国医药科技出版社， 2000:34.

　　［5］金鸣,蔡亚荣,李金荣,等. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/ Fe2+产生的羟自由基［J］. 生物化学与生物物理进展,1996,23（6）:553.