氧化苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

【摘要】 　　目的 探讨不同浓度的氧化苦参碱对人骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。方法将不同浓度的氧化苦参碱作用于培养的OS732 骨肉瘤细胞, 通过MTT 比色法、流式细胞仪和DNA 凝胶电泳、光学显微镜技术观察检测细胞凋亡, 研究分析其对骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。结果浓度为1.77，3.55，5.32mmoL/L的氧化苦参碱对OS732 骨肉瘤细胞相对抑制率分别为16.4%，29.0%，47.0%；流式细胞技术显示骨肉瘤细胞的凋亡率分别为11.8%，18.6%，27.7%；DNA 电泳见DNA“梯形”图谱；显微镜显示细胞的凋亡形态。结论 氧化苦参碱能显著抑制OS732 细胞增殖、促进其凋亡。

【关键词】 骨肉瘤细胞 氧化苦参碱 凋亡

　　Abstract:ObjectiveTo study the growth-inhibitory effect and the mechanism on apoptosis induced by oxymatrine on OS732 osteosarcoma cells.MethodsOsteosarcoma cells were treated with oxymatrine for 3 days. The cyto- toxicity was observed by MTT assay. The apoptotic rates were shown by flow cytometry (FCM ). Electron microscopy and DNA gel electrophoresis were applied to demonstrate of the presence of apoptosis. ResultsWhen osteosarcoma cells were treated with oxymatrine (1.77, 3.55 and 5.32 mmol/L ) , the cytotoxicity indexes were 16.4% , 29.0% and 47.0% respectively, the apoptostic rates were 11.8%，8.6%，27.7%. The obvious apotosis morphological changes in osteosarcoma cells were shown by electron microscope. ConclusionOxymatrine is able to inhibit the proliferation and induce the apoptosis of OS732 cells significantly. It is a potential and valuable proposal for clinical treatment of osteosarcoma.

　　Key words:Osteosarcoma; Oxymatrine; Apoptosis

　　氧化苦参碱(oxymatrine)是从豆科植物苦参、苦豆子中提取的有效成分，具有广泛的生物活性,其抗病毒、抗炎及对中枢神经系统的镇静、镇痛、解热、降温作用和强心、降压、抗心率失常、调节免疫功能已被广泛用于临床各科［1］。近几年，氧化苦参碱的抑瘤作用已逐步被证实。如氧化苦参碱诱导人乳腺癌细胞的凋亡［2］，对小鼠肉瘤S180的抑制作用［3］。

　　本实验选用不同浓度的氧化苦参碱作用OS732细胞，检测细胞凋亡的各项指标，为氧化苦参碱在抗肿瘤治疗方面提供一定的参考价值。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料

　　氧化苦参碱由宁夏紫荆花药业股份有限公司提供,纯度99.8%，批号20040402； 人骨肉瘤细胞株OS732 购自北京积水潭医院骨科研究所。RPMI l640 购自美国sigma公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。MTT试剂，美国Sigma 公司产品；流式细胞仪，美国Becton Dick in song 公司 ; 普通光镜，日本Olympus公司产品；5%CO2 孵箱，日本公司产品，型号cpd-1700。超净工作台，苏净集团安泰公司，型号：AIR;胰酶购自Gibco 公司。MTT 酶联免疫光电吸收仪，购自南京国营华东电子厂，型号DG- 3022A.

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 细胞的培养　

　　将O S732 细胞置于含10% 小牛血清的RPM ll640 培养液，于37℃，5%CO2湿度100% 的培养箱孵育。维持细胞处于对数生长期，备用。

　　1. 2. 2 四氮噻唑蓝(MTT)比色法取指数生长期生长状态较佳的细胞, 经0. 25%胰酶消化后配制成浓度为1×105cell/ml 的细胞悬液,取96孔板, 每孔接种1×104 个细胞, 按氧化苦参碱浓度为1.77，3.55，5.32 mmol/L［2，4］作用于细胞,每浓度设5个复孔， 于第3 天 每孔加入MTT 溶液(5 mg/ml ) 30 μl，继续孵育4h, 终止培养,弃上清液, 每孔加入100 μl 二甲亚砜,振荡10 min, 选择570 nm 波长, 在自动酶联检测仪上测定各孔光吸收值(A),并

计算其生长抑制率。　抑制率（%）=阴性对照组A值-试验组A值）阴性对照组A值×100%

　　1.2. 3 流式细胞仪(FCM ) 分析收集氧化苦参碱浓度为1.77，3.55，5.32 mmol/L 作用后的1×106 个OS732骨肉瘤细胞, 经0.25%胰酶消化后,取细胞培养液200 μl,1 000 r/min离心5 min，弃上清液,PBS洗涤2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液,加冷的70%乙醇4℃固定24 h，离心弃乙醇，PBS洗1次,1 000 r/min离心5 min，弃上清液，滴加0.5 ml 100 μg/ml RNase，放置4 h，离心弃上清液，PBS洗1次，300目筛网过滤1次, 1 000 r/min离心5 min，弃上清液,加0.5 ml碘化丙啶（P I）过夜。上流式细胞仪测定。分析亚二倍体峰, 分析细胞凋亡比例［5］。

　　1. 2. 4 细胞DNA 提取和电泳观察　胰酶消化后，收集药物作用组及对照组培养细胞(5×106 个),常规方法提取细胞DNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳,在室温,电压5 V,恒流60 mA,电泳2 h。紫外灯下观察。

　　1. 2. 5 光学显微镜下形态学观察 收集各组细胞, PBS 液洗涤2 遍, 做离心涂片，用甲醇固定3～5 min，滴加wright染色2 min，入 wright磷酸缓冲液4～10 min ，用蒸馏水冲洗，在显微镜下观察细胞形态。

　　1. 2. 6 统计学分析　实验数据用±s表示,用SPSS10.0 统计软件, 采用方差分析方法进行处理。

　　2 结　果

　　2. 1 对吸光度及细胞生长的影响OS732 细胞单独与浓度分别1.77，3.55，5.32 mmol/L的氧化苦参碱作用后, 吸光度(A ) 值,细胞生长抑制率值见表1，氧化苦参碱各药物浓度组分别和相应的对照组比较，均有显著性差异（P<0.05），其对OS732细胞的生长有显著的抑制作用，且抑制作用与药物浓度之间有明显的量效关系。见图1。表1 氧化苦参碱作用OS732骨肉瘤细胞后的A 值及相对抑制率(略)

　　2. 2 氧化苦参碱对O S732 细胞的凋亡诱导作用 氧化苦参碱浓度为1.77，3.55，5.32 mmoL/L 时, 凋亡率分别为11.8%，18.6%，27.7%。

　　2. 3 琼脂糖凝胶电泳　用苦参碱处理O S732 细胞3 d，DNA凝胶电泳可出现梯状DNA , 大小为180bp 及其整倍数。见图2。2. 4 光学显微镜下观察细胞形态学变化各种浓度的氧化苦参碱均可诱导细胞凋亡, 表现为典型的细胞凋亡特征性变化：细胞皱缩；胞膜结构完整；胞核固缩或崩解；染色质浓缩，表现为新月性胞核, 同时细胞器（如线粒体）等保持完整的形态。

　　3 讨论

　　中医药以其完整的医学理论体系和丰富的临床实践经验，其中有些天然药物成分是通过诱导肿瘤细胞分化、凋亡等方式治疗肿瘤。苦参为豆科槐属植物苦参的根, 味苦, 性寒, 归心、肝、胃、大肠、膀胱经, 功能清热燥湿、杀虫、利尿。现代药理研究证实苦参中所含的氧化苦参碱成分具有较好的抗肿瘤活性［6］。本研究中,MTT 试验证实氧化苦参碱抑制骨肉瘤细胞的生长, 且随着氧化苦参碱浓度的增加,抑制率也增加。

　　抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制方式有多种, 如诱导细胞分化、凋亡和坏死均为肿瘤生长抑制的表现方式, 细胞凋亡属不可逆死亡, 不存在复发, 能彻底治愈肿瘤。近几年肿瘤生物治疗的热点之一是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡从而达到治疗肿瘤目的, 此种疗法称肿瘤的凋亡疗法。我们认为氧化苦参碱对体外培养OS732 骨肉瘤细胞的抑制是通过诱导细胞的凋亡发生的, 从而可以解释其抗肿瘤作用。

【参考文献】
　　［1］李正蓉.苦参素的药理与临床进展［J］.华西药学杂志,2003,18(6)：435.

　　［2］周炳刚，孙靖中.氧化苦参碱诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的实验研究［J］.中国药理学通报，2002，18（6）：689.

　　［3］福岛清吾.特许公报［P］.日本，1972：7703749.

　　［4］王兵，王国俊，蔡 雄.氧化苦参碱抑制肝癌细胞诱导血管内皮细胞增值作用的研究［J］.肿瘤防治杂志，2003，10（7）：708.

　　［5］姜泊，周殿元.细胞凋亡基础与临床［M］.北京：人民军医出版社，1999：285.

　　［6］陶上乘, 王静珍. 苦豆子生物碱的药理作用［J］.中国药学杂志,1992, 27（4）：201.