简介:目的:丹参酮Ⅱ-A是丹参的一种重要成分。研究丹参酮Ⅱ-A的抗炎症机制。方法:以小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7作为药物刺激靶细胞,使用不同浓度的分析纯丹参酮Ⅱ-A对RAW264.7细胞系进行刺激,在细胞被刺激24、48h后,使用MTT比色法和半定量RT-PCR法对刺激后的细胞进行检测。结果:通过MTT比色法检测,发现丹参酮Ⅱ-A抑制炎症细胞的增殖,初步计算出丹参酮Ⅱ-A的半抑制浓度(IC50)为43.2μmol/L;在半定量RT-PCR实验中发现,在发生炎症后,丹参酮Ⅱ-A通过抑制磷脂酶A2来减轻炎症。结论:在炎症发生后,丹参酮Ⅱ-A通过抑制磷脂酶A2来达到其抗炎症的作用。
简介:目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。
简介:目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×10^3的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。
简介:目的:基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法:利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan~R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P1169-Kan~R串联序列,经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后,连接至经同样双酶切的pMMB207骨架上,构建穿梭载体p207-GK;将穿梭载体电转化至贝氏柯克斯体,用ACCM-2培养基进行传代培养或感染BGM细胞;利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用半固体平板培养法克隆分纯贝氏柯克斯体转化株。结果:构建了贝氏柯克斯体穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的贝氏柯克斯体转化株,并完成了克隆分纯。结论:建立了完整的贝氏柯克斯体转化系统,为后续用遗传学方法研究贝氏柯克斯体奠定了基础。
简介:目的:在类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜(FLS)细胞中筛选并鉴定盘状结构域受体2(DDR2)的相互作用蛋白,并研究其对FLS细胞侵袭能力的影响。方法:首先利用免疫沉淀结合SDS-PAGE分离鉴定DDR2互作蛋白波形蛋白,进而采用免疫沉淀和激光共聚焦实验,进一步验证波形蛋白是DDR2的相互作用蛋白,最后采用Transwell实验考察波形蛋白对RAFLS细胞侵袭能力的影响。结果:Ⅱ型胶原刺激引起RAFLS细胞中DDR2的磷酸化水平升高,DDR2被活化,活化前后共有8个DDR2相互作用蛋白发生变化,经质谱分析,其中变化最大的是波形蛋白和膜联蛋白A2;在HEK293T细胞中,免疫共沉淀结果显示FcDDR2与波形蛋白存在相互作用;激光共聚焦结果显示在RAFLS细胞中,DDR2和波形蛋白存在共定位;下调RAFLS细胞中波形蛋白的表达后,细胞的侵袭能力较对照组显著下降。结论:波形蛋白是DDR2的相互作用蛋白,Ⅱ型胶原可引起RAFLS细胞的DDR2磷酸化水平升高,并通过波形蛋白促进RAFLS细胞的侵袭。
简介:目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10^8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。
简介:目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3~6s)升至10倍,200s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5~8s),并且回落更慢,300s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。
简介:目的:通过弱化筛选基因二氢叶酸还原酶基因(dhfr),构建双顺反子全抗体表达载体,实现全抗体在CHO细胞中的高效表达。方法:将dhfr基因分为分别编码1-105和106~187氨基酸残基的2部分,分别通过linker与亮氨酸拉链GCN4融合,分别通过内部起始位点序列与抗体轻重链基因偶联,构建成2个双顺反子表达载体pIRESLZdhfr—H和pIRESLZdhfrL。用脂质体2000转染CHO-dhfr-细胞,用无次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的IMDM筛选培养基筛选阳性克隆。结果:筛选到的阳性克隆表达水平为1.47-3.5μg/(106细胞·d),经氨甲蝶呤(MTX)梯度加压,在MTX浓度为5×10^-8mol/L时,表达水平达到11.5μg/(10^6细胞·d)。结论:构建了基于亮氨酸拉链二聚化基础的dhfr弱化方式的双顺反子表达载体,实现了全抗体在CHO—dhfr-细胞中的高效表达。
简介:目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698。方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western印迹检测蛋白表达。结果:构建了真核表达载体pEGFP-N1-mpafp698,在转染后24h可检测到绿色荧光的表达,而对照组则没有检测到荧光蛋白;Western印迹结果显示表达蛋白的相对分子质量约37000。结论:为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白的细胞表达及功能研究奠定了基础。