简介：摘要目的观察缺氧环境对破骨细胞形成的影响，探讨缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在其中的调控作用。方法在正常氧浓度、5%O2浓度和1%O2浓度条件下诱导培养破骨细胞，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色后进行计数。Western blot检测缺氧条件下破骨细胞中HIF-2α的表达。应用HIF-2α抑制剂PT2385(5 μmol/L)抑制HIF-2α活性后，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测破骨细胞功能相关基因的表达。结果TRAP染色显示骨髓基质单核细胞(BMM)可成功诱导成多核的破骨细胞；破骨细胞的数目在正常氧组为(55.1±8.2)个，5%O2低氧组为(72.5±10.7)个，1%O2低氧组为(94.7±15.6)个，差异有统计学意义(F＝8.341，P<0.05)。破骨细胞在低氧条件下HIF-2α的蛋白表达增高，5%O2低氧组为正常氧组的3.1倍，1%O2低氧组为正常氧组的6.5倍，差异有统计学意义(F＝21.070，P<0.05)。TRAP、组织蛋白酶K(CK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、活化T细胞核因子1(NFATc1)基因表达在5%O2低氧组升高，PT2385(5 μmol/L)可抵消低氧这种作用，差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧环境可以通过激活HIF-2α促进破骨细胞的形成和分化，阻断HIF-2α可抑制破骨细胞的骨吸收功能。

简介：摘要目的探讨bFGF对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖能力和细胞周期的影响。方法2019年1月至2019年12月,共收集6例因股骨颈骨折行全髋关节置换术的患者骨髓,运用密度梯度离心法分离培养hBMSCs,流式细胞术分析评估其纯度。选第3代细胞进行实验,实验组用含10 ng/ml bFGF的F12培养基培养,对照组用常规F12培养基培养；培养第1、3、5、7天,CCK8检测hBMSCs增殖能力并制作细胞生长曲线图；实验组bFGF连续培养72 h后进行β-半乳糖苷酶染色检测其衰老状况,PI染色结合流式细胞术测定细胞周期；Real-time PCR检测干性基因Nanog、细胞周期相关基因CyclinD1、CDK2和CDK4的相对表达量；数据采用非配对t检验或者ANOVA（SNK）进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果实验组hBMSCs生长速度较对照组快,bFGF连续培养72 h后,细胞衰老比例较对照组显著减少（P<0.05）。细胞周期检测显示实验组G0/G1期细胞比例（72.67%）明显低于对照组（81.69%）,而S期比例增高,二者分别为11.94%和1.26%,差异有统计学意义（P<0.05）。实验组衰老细胞比例[（19.64±1.47）%]较对照组[（60.8±0.73）%]明显减少（P<0.05）。Real-time PCR检测显示实验组干性基因Nanog和细胞周期相关基因CyclinD1、CDK2、CDK4表达量较对照组明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论bFGF能上调干性基因和细胞周期相关基因的表达,促进细胞增殖和细胞周期进展,延缓细胞衰老,且不改变细胞的免疫表型。

简介：摘要目的观察微小RNA(microRNA，miR)-219a-5p在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达及其对细胞增殖和成骨分化的影响。方法选取在2019年1月至2020年1月期间于河南省人民医院骨科接受髋关节置换的16例激素性股骨头坏死患者及9例股骨颈骨折不愈合患者分别作为实验组及对照组，提取股骨近端BMSC，利用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-219a-5p和卷曲蛋白4(FZD4)在细胞中的表达水平。荧光素酶活性检测验证miR-219a-5p和FZD4的相互作用关系。利用细胞转染技术和miR-219a-5p的模拟物、抑制剂、FZD4发卡RNA(shRNA)来调控BMSC中miR-219a-5p和FZD4的表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)增殖实验检测BMSC的增殖活性，茜素红染色评估BMSC的成骨分化能力。利用统计与制图软件(GraphPad Prism)统计分析实验数据。采用方差分析(ANOVA)和t检验确定计量资料各组间差异的统计学意义，计数资料的组间比较采用方差检验。结果miR-219a-5p在实验组BMSC中的相对表达量为6.03±1.39，而在对照细胞中的相对表达水平仅有1.01±0.21，两组之间差异有统计学意义(t＝10.351，P<0.01)。利用数据库TargetScan预测得到miR-219a-5p的下游靶基因FZD4，RT-qPCR结果提示FZD4在实验组细胞中的表达水平为1.09±0.55，在对照组细胞中相对表达量达到4.61±1.08，两组之间差异有统计学意义(t＝10.376，P<0.01)。皮尔森(Pearson)线性分析显示miR-219a-5p和FZD4在BMSC中表达水平呈负相关[r＝-0.631，95%可信区间(CI)：-0.763、-0.498，P<0.01]。下调实验组中miR-219a-5p的表达后，FZD4的水平升高4.34倍(t＝8.426，P<0.01)，而在对照组细胞中上调miR-219a-5p的表达后，FZD4的表达水平下降4.75倍，差异均有统计学意义(t＝8.667，P<0.01)。荧光素酶活性检测证实了miR-219a-5p与FZD4之间的结合关系。CCK-8实验结果显示实验组BMSC培养24、48、72 h后的吸光度值分别为0.27±0.05、0.48±0.05、0.63±0.04显著低于对照组的BMSC的0.46±0.05、0.96±0.08、1.51±0.11，两组之间差异具有统计学意义(t＝9.776，P<0.01)。抑制实验组中miR-219a-5p表达后细胞的增殖活性明显提高，而同时敲低FZD4的表达则会逆转上述作用。同样地，将miR-219a-5p模拟物转染对照组细胞，细胞增殖活性明显抑制。茜素红染色显示对照组细胞的阳性染色面积/总面积为0.58±0.05，明显高于实验组的0.22±0.04，差异有统计学意义(t＝7.610，P<0.01)。在实验组细胞中转染miR-219a-5p抑制剂可以增强细胞的成骨分化能力，但FZD4 shRNA抵消了miR-219a-5p抑制剂对成骨能力的强化作用，且上调正常BMSC中miR-219a-5p的水平可以阻止其成骨分化过程。结论miR-219a-5p在激素性股骨头坏死BMSC中高表达，FZD4介导了miR-219a-5p对BMSC增殖及成骨分化的抑制作用。