简介：目的建立一种能在临床上快速、准确地检测大鼠疑似泰勒氏病毒（Theiler’s-likevirusofrats,TLV）的方法,采用TaqMan探针荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术,特异性针对TLV病毒核酸进行检测。方法通过基因合成序列作为质粒标准品的模板,同时选择特异性的序列在3622~3729nt处,设计一对引物和TaqMan性探针,优化反应体系及条件,进行qPCR扩增,从而建立TLVTaqMan探针qPCR方法,并对其灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果建立的TLVqPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R~2值可达到0.99,灵敏性最低能够检测到10个拷贝数/μL,对比普通PCR方法,高出其100倍;对其他常见大鼠病毒均无非特异反应;重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%。结论利用TaqMan探针建立快速检测TLV的荧光定量PCR方法,该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。

简介：目的通过研究三种不同＂二次打击＂急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS）动物模型的特点,寻找较为理想的ARDS动物模型。方法将48只大鼠随机分为4组,每组12只。对照组（Control组）：尾静脉先注射生理盐水（normalsaline,NS）2.5mL/kg,30min后注射NS2.5mL/kg;油酸＋油酸组（OA＋OA组）：尾静脉先注入OA0.05mL/kg,30min后继续注射OA0.5mL/kg;内毒素＋内毒素组（LPS＋LPS组）：尾静脉先注入LPS2.5mg/kg,30min后继续注射LPS2.5mg/kg;油酸＋内毒素组（OA＋LPS组）：尾静脉先注入OA0.05mL/kg,30min后注射LPS2.5mg/kg。5h后处死动物采集标本,检测动脉血气,支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）中白细胞总数、多形核白细胞百分比（polymorphonuclearleukocyteratio,PMN%）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactorα,TNF-α）水平、总蛋白含量,肺干湿重比（lungwet-dryweightratio,W/D）,观察肺组织病理改变并进行肺损伤评分。结果与control组比较,LPS＋LPS组、OA＋OA组及OA＋LPS组的氧分压（PaO2）下降（P〈0.05）、二氧化碳分压（PaCO2）、BALF中白细胞总数、PMN%、TNF-α、总蛋白含量,W/D、肺损伤评分均升高（P〈0.05）。OA＋LPS组总蛋白含量、W/D均高于LPS＋LPS组,差异有显著性（P〈0.05）,而与OA＋OA组比较则差异无显著性;OA＋LPS组BALF中白细胞计数、PMN%、TNF-α较OA＋OA组高（P〈0.05）,而与LPS＋LPS组比较则差异无显著性;OA＋LPS组肺病理改变最典型,肺损伤评分最高。结论OA＋OA、LPS＋LPS和OA＋LPS复合打击法均可建立＂二次打击＂ARDS大鼠模型,其中OA＋LPS复合打击法所复制的ARDS模型与临床ARDS特点更为接近,有利于研究ARDS的病理生理过程,是一种较为理想的＂二次打击＂ARDS动物模型。

简介：目的建立利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对小鼠ＭＡＤ２Ｌ１基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９对ＭＡＤ２Ｌ１基因编辑的脱靶效应。方法通过ＣＨＯＰＣＨＯＰ网站设计位于小鼠ＭＡＤ２Ｌ１基因第二外显子的靶点序列，并构建Ｃａｓ９?ＭＡＤ２Ｌ１载体，将该载体转染到ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察ＧＦＰ后，提取细胞转染后的基因组ＤＮＡ，利用ＰＣＲ方法，结合Ｔ７Ｅ１分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠ＭＡＤ２Ｌ１基因编辑情况，并对转染后的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞进行ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９脱靶效应分析。结果将Ｃａｓ９?ＭＡＤ２Ｌ１载体转染到ＮＩＨ／３Ｔ３细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达ＧＦＰ的细胞，ＰＣＲ结合Ｔ７Ｅ１结果显示，以转染后的细胞ＤＮＡ为模板扩增出的２２８ｂｐＭＡＤ２Ｌ１ＰＣＲ产物，可被酶切成１６６ｂｐ和６２ｂｐ片段，测序结果显示，成功对ＭＡＤ２Ｌ１基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠ＭＡＤ２Ｌ１基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对ＭＡＤ２Ｌ１基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。

简介：目的测定SPF级C1型尼曼-匹克病小鼠（Npc1-/-小鼠）的生长繁殖及血液生理生化指标,为开展NPC1病人的研究提供理论性的基础资料。方法（1）选取077日龄Npc1-/-、Npc1＋/-和Npc1＋/＋小鼠雌雄各40只,定期称重并绘制生长曲线;（2）Npc1-/-小鼠由Npc1＋/-小鼠交配繁殖产生,统计Npc1＋/-小鼠连续4代的繁殖数据;（3）检测60日龄Npc1-/-和Npc1＋/＋小鼠的血液生理生化指标。结果（1）Npc1-/-小鼠的体重在7周前随着日龄的增加而增加,7周后随着日龄的增加而减少,直至11周左右死亡。Npc1＋/＋和Npc1＋/-小鼠的体重均随着日龄的增长而逐渐增加,两者之间并没有显著差别。4周后雄性比雌性体重增加明显比雌性小鼠快;（2）Npc1＋/-小鼠不同代内交配分娩间隔、窝产仔数、离乳仔数、离乳仔数中雌雄数量及阳性数量差异无显著性（P〉0.05）,而第2代的离乳率明显大于第1代（P〈0.05）;（3）Npc1-/-和Npc1＋/＋小鼠血液生理指标中平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和平均过氧化物酶指数（MPXI）差异有显著性（P〈0.05）,其余差异无显著性（P〉0.05）。生化指标中尿素（UREA）差异有极显著性（P〈0.01）,而天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、葡萄糖（GLU）、乳酸脱氢酶（LDH）、钾（K）和铜（Cu）等差异有显著性（P〈0.05）,其余差异无显著性（P〉0.05）。结论（1）Npc1-/-、Npc1＋/-和Npc1＋/＋小鼠的生长曲线因基因型和性别的不同而存在差异;（2）Npc1＋/-小鼠不同代的繁殖能力差异无显著性;（3）Npc1-/-和Npc1＋/＋小鼠的部分血液生理生化指标差异有显著性。