简介：摘要目的探讨氧化应激刺激下心肌细胞释放外泌体对巨噬细胞极化的影响及其机制。方法取H9C2心肌细胞，采用随机数字表法分为0 µmol/L组、100 µmol/L组、200 µmol/L组、300 µmol/L组，分别用相应浓度H2O2处理后，各组使用细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）检测细胞活力，Western blot法检测细胞活化形式胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2-associated X protein, Bax）水平变化，流式细胞术检测细胞凋亡情况，根据检测结果选用最适处理浓度进行后续实验。另取H9C2心肌细胞，参考经典的超速离心法，提取正常心肌细胞来源外泌体（normal cardiomyocyte-derived exosomes, NC-exo）及氧化应激心肌细胞来源外泌体（oxidative stress cardiomyocyte-derived exosomes, H-exo），透射电镜观察外泌体形态，Western blot法检测外泌体标志蛋白。激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞对外泌体摄取内化情况。选取正常培养巨噬细胞，按随机数字表法分为对照1组（NC1组）、脂多糖1组（LPS1组）、正常心肌细胞来源外泌体预处理+脂多糖组（LPS+NC-exo组）、氧化应激心肌细胞来源外泌体预处理+脂多糖组（LPS+H-exo组）。LPS1组LPS处理6 h, LPS+NC-exo组、LPS+H-exo组分别加入NC-exo、H-exo预处理24 h再进行LPS处理6 h, NC1组不进行处理。使用Western blot法检测诱导型一氧化碳合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）、CD86、CD206水平，使用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）方法检测IL-6、TNF-α、趋化因子-10（chemokine-10, CXCL-10) mRNA水平。采用RT-qPCR方法检测外泌体miRNA表达量。另取巨噬细胞按随机数字表法分为对照2组（NC2组）、脂多糖2组（LPS2组）、过表达阴性对照+脂多糖组（LPS+mimic-NC组）、过表达miR-106b-5p+脂多糖组（LPS+106b-mimic组）。LPS2组LPS处理6 h，LPS+mimic-NC组、LPS+ 106b-mimic组则分别使用转染试剂mimic-NC、106b-mimic转染24 h再进行LPS处理6 h，NC2组不进行处理。检测iNOS、Arg-1、CD86、CD206水平及IL-6、TNF-α、CXCL-10的mRNA表达水平。结果与0 µmol/L组比较，100 µmol/L组、200 µmol/L组、300 µmol/L组凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3水平升高（P<0.05），Bcl-2水平下降（P<0.05），细胞活力下降（P<0.05），细胞凋亡率上升（P<0.05）。经比较，200 µmol/L作为适宜浓度用于后续实验。通过显微镜观察，正常心肌细胞表现为梭形，而200 µmol/L H2O2处理后心肌细胞皱缩变形死亡。透射电镜观察可见提取的纳米颗粒呈现圆形并具有双层膜结构，将荧光标记的外泌体加入巨噬细胞中共同培养24 h，可见大量外泌体能够被巨噬细胞摄取。与NC1组比较，LPS1组、LPS+NC-exo组、LPS+ H-exo组iNOS、CD86蛋白水平升高（P<0.05），Arg-1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、CXCL-10 mRNA水平升高（P< 0.05）；与LPS1组比较，LPS+H-exo组iNOS、CD86蛋白水平升高（P<0.05），Arg-1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、CXCL-10 mRNA水平升高（P<0.05），而LPS+NC-exo组与LPS1组差异无统计学意义（P>0.05）。与NC-exo比较，H-exo中miR-106b-5p表达升高（P<0.05）。与NC2组比较，LPS2组、LPS+mimic-NC组、LPS+106b-mimic组iNOS、CD86蛋白水平升高（P< 0.05），Arg-1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、CXCL-10 mRNA水平升高（P<0.05）；与LPS2组比较，LPS+106b-mimic组iNOS、CD86蛋白水平升高（P<0.05），Arg-1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、CXCL-10 mRNA水平升高（P< 0.05），而LPS+mimic-NC组与LPS2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论来源于氧化应激心肌细胞的高表达miR-106b-5p的外泌体促进巨噬细胞发生M1型极化。