微滴式数字PCR技术的研究进展

微滴式数字PCR技术的研究进展

崔丽丽1，4，张然2，何建安2，陈曦1，贾青1，顾大勇3*，李华文1*，

（1广东医科大学公共卫生学院，广东 东莞523109；2深圳国际旅行卫生保健中心（深圳海关口岸门诊部），广东 深圳518000；3深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院)，广东 深圳518035；4深圳市检验检疫科学研究院，广东 深圳518000）

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是Kary Mullis等人提出的一种人工扩增DNA的方法，从一开始就在生物技术、细胞生物学、分子生物学等各个领域得到了广泛应用[1]。在第一代PCR技术中，模板DNA、引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)和缓冲溶液被混合在一起，经历变性、退火、延伸一系列热循环，产生数百万个模板DNA拷贝，通过扩增子的片段大小对靶基因进行定性检测。随着PCR方法的不断改进，PCR也由定性分析发展到定量分析。

数字PCR(digital PCR，dPCR)将传统PCR的指数信号转换成线性数字信号，并在仪器中利用统计学方法分析PCR产物，在DNA定量分析方面有着显著优势。伴随微流控领域的不断发展，与数字PCR技术结合所衍生出的微滴式、微孔式、微腔式数字PCR等，相比于传统数字PCR，其灵敏度和精准度有了很大提升，且操作简单，样品消耗量少。因此，自数字PCR问世以来，已在精准医疗[2–4]、微生物检测[5–8]、食品安全[9-10]等多个领域获得广泛应用。

1 数字PCR技术

“数字PCR”一词由Vogelstein和Kinzler在1999年创造[11]。他们的开创性论文报道了一种将PCR的指数型函数转换为线性函数的新方法。在市售的384孔板上对结、直肠癌患者的粪便样本进行了实验，实验成功地证明了在患有结、直肠癌患者的粪便样本中存在突变的KRAS基因。在dPCR中，含有PCR反应混合物以及必要荧光团的反应溶液，被有限稀释为数以万计的较小单元，每个单元经历着与传统PCR相同的热循环。通过荧光染料可以识别出PCR反应阳性的单元，将含有正荧光的独立单元被认为是“1”，而没有荧光或负荧光的独立单元被认为是“0”，类似于数字电子学中的信号，根据相对比例和反应器的体积，利用泊松分布统计原理可以推算出原始溶液的核酸浓度[12-13]。

根据样品分割方式的不同，当前数字PCR主要分为微流体数字PCR（microfluidic digital PCR, mdPCR）、芯片式数字PCR（chip digital PCR，cdPCR）和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）。cdPCR是dPCR技术最早发展的形态，包括多孔板与芯片两种形式[14]。多孔板式dPCR由于反应孔的体积在微升级以上，主要依靠模板多次稀释来达到合适的体积大小，操作相对繁琐，而且反应通量太低，限制了反应的动态范围，另外对试剂及样本的消耗也非常大，不具备成本效益，在芯片技术还不成熟的早期有过一些应用[15]。随着微流控芯片技术不断发展进步，专属于微流体的特殊规律、操控方法被越来越多的研究者们发现，重视并加以利用，使得高效率、高密度、自动化地平均分割宏观体积的（水性、油性及氟性）液体成为可能，终体积可实现从微升到飞升[16]乃至阿升[17]的飞跃。各种基于芯片腔室的dPCR正是在这一背景下应运而生，解决了传统多孔板法的各种弊端，为dPCR概念的普及及应用的推广奠定了坚实基础[18–25]。它们中已商品化的有阀门式芯片、微孔式芯片、封压式芯片等。

ddPCR已发展成为目前最流行的商业dPCR技术，它采用微流控的方法来形成稳定均一的油包水液滴，经扩增反应后再收集液滴进行单通道或多通道的荧光检测分析。在表面活性剂的帮助下，这种两相流体控制技术可自由地将任意体积预扩增混合液分割为皮升级的反应单元，反应通量几乎不受限制，因此动态范围较预制分区型数字PCR更广，可达5-6个数量级，同时还可以更方便地进行多重ddPCR检测[26]。具有代表性的ddPCR系统分别是Bio-Rad公司的QX100TM/QX200TM数字PCR系统、RainDance公司的RainDropTM数字PCR系统及StillaTechnology公司的NaicaTM数字PCR系统。

dPCR的扩增载体从多孔板、毛细管阶段，发展到目前的微芯片和微液滴阶段，不仅将操作简单化，降低了反应的总体成本，更是提高了反应体系的液滴数量和实验灵敏度。

2 微滴数字PCR技术

ddPCR由二代测序中“油包水PCR”技术发展而来，其优势在于微滴的体积可以从纳升级到皮升级进行调整，从而为微滴式数字PCR系统提供更高的反应通量和更好的扩展性，且油包水的反应体系也具有更好的生物兼容性，能够提供良好的PCR反应条件。微滴式数字PCR的关键过程包括液滴生成、热循环和输出监测。

2.1 液滴生成技术

液滴生成的目的，是将PCR混合物分解成更小的单元以进行热循环的过程。每个dPCR样本室预计拥有最多一个核酸模板，以保证高准确度的测量。常用液滴生成方法包括T型通道方法[27–29]、流动聚焦法[30–32]和共流聚焦法[29-30]。主动生成方法包括基于介电泳的液滴生成[35–37]和基于电润湿的液滴生成[38–40]。使用T型通道、流动聚焦和共流聚焦的微流体液滴生成是数字PCR平台中最常用的方法。此外将微滴式与气动[41]、静电[42]、和磁性[43]的外部驱动相结合，使得其在数字PCR中更受欢迎。

Beer等[44]在2007年报道了一种基于实时芯片上液滴式数字PCR装置的设计和开发。在平均体积为13 pL的油包水微滴中进行PCR反应，使用结尺寸为60 μm的片上疏水T型结通道实现了较小的液滴尺寸。为了提高荧光监测系统的视场，通道尺寸在下游增加到300 μm。注射泵将反应体系输入装置内部，此泵为液体流速提供较好的控制，以实现单分散液滴的理想尺寸。液滴生成的频率也是微流控液滴生成的一个重要方面，通过调节流量可以控制液滴产生的频率。然而，由于缺乏反馈系统来监测液滴大小及其形成的频率，限制了这类装置的可靠性。Crawford等[45]报告了一个反馈控制系统，有助于产生高度单分散的微液滴与所需的生成频率，这样可以减少液滴融合和交叉污染的可能性。以自动化的注射泵为基础的微流体系统相对简单，注射泵可以为液滴生产过程提供闭环反馈。

Tanaka等[46]提出了一种无需手动操作的方法，利用PDMS微流控芯片进行液滴生成。该设计由一个T型通道微流控芯片组成，该芯片在结处宽度为50 μm，在上游和下游区域宽度为250 μm。通道与两个入口储存器和一个出口储存器相连。当脱气的PDMS芯片恢复到标准大气压时，气体会扩散到PDMS芯片中。因此，如果入口储存器充满油和PCR反应物，液体将通过通道自动泵送到出口储存器，从而在油中产生单分散PCR反应物液滴。该小组通过改变通道尺寸成功地演示了液滴大小的可调性。这种方法的另一个优点是它不需要额外装置来产生液滴。然而，对PDMS芯片在使用前的除气过程是比较耗时的。此外，随着时间的延长，产生液滴的频率和速度也会降低。液滴通过通道的速度减慢，其融合的可能性大大升高。由于没有外部泵和管道的额外装置，此结构较为小巧，但人工干预和繁琐的芯片预处理步骤，大大降低了其在实际中的应用。利用同样的概念，此团队还设计了一种流动聚焦结构用于在油中产生单分散的样本液滴。

2.2 热循环技术

热循环是将生成的样本液滴在不同温度下进行PCR热循环的过程。传统PCR使用具有高度精确温度控制的程序化热循环仪来执行热循环。温度的准确性及其持续时间的长短决定了PCR的扩增效率。加热期间，尤其是冷却期间的升温速率是影响数字PCR整体效率和特异性的另一个重要参数。对于升温速率较差的热循环技术，会延长所需的PCR循环时间；而较差的冷却速率会牺牲扩增特异性。因此，热循环系统在数字PCR中发挥着重要作用。

2.2.1 焦耳加热

焦耳加热依赖于通过欧姆导体的电流，也称为电阻加热器，独立或集成的电阻加热器均可用于PCR反应物的热循环。在独立加热器中，加热元件与PCR反应室是分开的，以物理接触形式进行热循环。在集成装置的情况下，电阻加热器的材料可直接附着在PCR反应室表面。EI-Ali等[47]在2004年开发了基于SU-8的PCR芯片，集成了铂微型加热器和温度传感器。该设备是第一个集成加热器和温度传感器的基于聚合物的PCR反应芯片。芯片腔体为20 μl，其快速加热和冷却速率分别达到50和30 K/s。该小组成功地扩增出酵母基因核糖体蛋白质S3和弯曲杆菌基因cadF。Liao等[48]研究出一种基于PDMS的实时PCR芯片，该芯片集成了铂微型加热器和铂温度传感器，系统的加热和冷却速率分别达到了20和10 K/s。该系统成功扩增并检测出登革2型病毒和肠道病毒（EV-71型）。

Neuzil等[49]提出了一种在微芯片上使用的低成本PCR发生装置。该装置包含了由显微镜盖玻片组成顶部的微加工硅芯片，硅芯片中集成了加热器和温度传感器。将1 μL的PCR样品放在玻璃片上，并用矿物油覆盖以防蒸发，矿物油作为PCR样品与微机械硅芯片之间的热接触。此装置只需半秒可从72 °C加热至94 °C，两秒钟从94 °C降温到55 °C。放置PCR样品的玻璃片是一次性的，因此这个装置在测试过程中高效地消除样品的交叉污染。

2.2.2 热电加热

当电流通过两个不同金属的连接处时，一个连接处会冷却，而另一处会加热，这种效应被称为“帕尔帖效应”(TEC)，是Jean Charles Athanase Peltier在1834年发现的。在许多传统PCR和qPCR技术中已经实现了使用热电加热技术的进行热循环[46-47]。TEC的主要优点是它能够根据输入偏置电压的极性来反转热效应。利用这一特性可以减少热循环的冷却时间，从而减少整个循环时间。热电模块的主要缺点是热惯性大。通过优化PCR反应室，可以提高基于“帕尔帖效应”的系统热响应。Yamaguchi等[51]将铜制PCR管尖端直接夹在P型和N型热电材料之间，这种设计使整个系统热响应的得到显著改善。

热电模块和焦耳加热模块可以混合用在热循环装置中。焦耳加热模块的高升温速率有利于缩短循环时间。热电加热技术可用于强制冷却过程中的冷却循环，这也减少了整个循环时间。

2.3 输出检测技术

PCR反应物成功热循环后会在每个微反应器中产生扩增和荧光。扩增DNA的检测和定量是数字PCR过程的最后阶段。现今广泛用于检测荧光输出的技术有两种，一是使用传感器，例如光电二极管、光电晶体管和光电倍增管；二是使用扫描装置，例如电荷耦合装置(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。

Mazutis等[52]对体外翻译酶的动力学进行分析。利用光电倍增管检测反应物中的漆酶活性的荧光。Pekin等[53]使用相同的设置来量化gDNA中突变的癌基因。实验装置由两束激光束组成，用于激发含有突变基因、野生型DNA相应荧光团的PCR产物的靶液滴。经过扩增后的突变基因发出绿光，而野生型发出红光，并利用PMT的电压输出变化量来量化突变基因。

使用扫描装置一般分为三个过程：首先以汞蒸气或激光灯为传统光源激发PCR微反应器的荧光；然后使用CCD/CMOS相机扫描荧光；最后扫描形成荧光图像进行数据处理，得到量化数据。Hatch等[54]报告了一种用于数字PCR的具有宽视场荧光成像的100万液滴阵列。该设备是一种基于微液滴式微流控平台，具有荧光成像功能。液滴阵列的荧光成像由具有CMOS和f/2.8 USM微距镜头的2100万像素数码相机并行捕获。该装置能够分别以1x和0.5x放大率对8.6和17.2 cm2的区域进行成像。该设备在11 cm2的观察区域内成功捕获了100万个50 pL的液滴，每个液滴的分辨率为15-20 像素。使用ImageJ和MATLAB进行图像和数据处理，根据液滴晶格均匀性、荧光均匀性、液滴重叠程度和放大液滴的百分比进行图像定量，只需要0.5-1.5小时。

总之，迄今为止报道的大多数数字PCR平台中使用的荧光检测系统在大小和成本方面都没有得到很好的优化。减小荧光检测系统的体积和成本对于设计和开发一个简单、紧凑、全自动和经济的数字PCR平台至关重要。Novak等[55]将传统荧光检测方法应用到“芯片实验室”中，开发了一个紧凑集成的荧光检测系统，使用LED作为激发源，光电二极管作为检测器。该系统集成了所有必要的电子、光学设备，以便在极小的芯片内有效地检测荧光。Peham等[56]在2011年展示了使用LED光电二极管传感器系统对PCR后产物进行荧光检测。

3 总结与展望

本文总结了微滴式数字PCR技术涉及的主要过程的研究现况，微滴式数字PCR相较于其他数字PCR具有明显的优势，微滴技术的兴起提高了反应通量，ddPCR可以将反应物溶液等分到数以万计的液滴中，并保证液滴的均一性和稳定性，大大提高了数字PCR的灵敏度;其次微滴式数字PCR芯片的制作相比于常规的微孔式、微腔式数字PCR芯片更加简单，缩小了技术成本;另外，由于通道和包含在微滴中的样品模板没有直接接触，减少了交叉污染及模板损失。但其缺点在于液滴的稳定性与可控性相对较差，液滴的少量融合难以避免，对于检测分析过程也提出了更高的要求，现有仪器对液滴都采用终点检测，在一定程度上也影响了数据的可信度。因此，液滴的稳定性、液滴终点监测分析的精准可靠性也是未来研究中的一大重点。