气相-质谱联用仪测定硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯的含量

气相-质谱联用仪测定硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯的含量

贾志祥1 ,叶丹1  ,赵健1

（1 江苏联环药业股份有限公司 江苏 扬州 225000）

摘要：目的：建立测定硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯的含量方法。方法：采用5%苯基-甲基聚硅氧烷为填料的毛细管柱（30m*0.25mm*0.25μm）为色谱柱；进样口温度为200℃；载气为氦气，流速为1.0mL/min；升温程序为初始温度60℃保持2min，以6℃/min升至80℃，再以40℃/min升至300℃，保持20min；采用分流进样模式；GC-MS接口温度为280℃；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；扫描离子为95；扫描模式为SIM模式；溶剂延迟3min；进样量为2μL。；结果：该方法检测灵敏度高，硫酸二甲酯的线性范围在限度浓度的5%~500%范围内线性关系良好；回收率、重复性、进样精密度与准确度均良好；溶液在0℃以下放置6h内溶液稳定性良好。结论：该方法灵敏度高、精密度及准确度良好，可用于硫酸二甲酯含量测定。

关键词：气相-质谱；硫酸氢氯吡格雷；硫酸二甲酯

硫酸氢氯吡格雷是一种抗血栓药物,它可以通过有效抑制血小板聚集来预防动脉粥样硬化血栓的形成[1]。硫酸氢氯吡格雷的生产中使用硫酸，硫酸遇到甲醇可能产生硫酸二甲酯。硫酸二甲酯属于甲基化试剂，有报告表明急性硫酸二甲酯中毒后可引起染色体畸变，欧盟 REACH 法规将硫酸二甲酯列入高度关注物质清单[2-3]。参考ICH M7中硫酸二甲酯可接受入量为1.5μg/天[4-5]，所以应对硫酸二甲酯的含量进行严格的检测和控制。

硫酸二甲酯极性大，不具备敏感的紫外吸收基团，并且容易水解。很难采用气相、液相色谱和其他常规分析手段对其进行痕量直接测定。而且硫酸氢氯吡格雷在结构上有其特异性，本身具有与硫酸二甲酯结构相似的酯基官能团，如用衍生化法分析会有假阳性风险。因此找到一种合适的检测方法来检测硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯的含量具有非常重要的意义。

本研究建立气相-质谱法[6-7]测定硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯的残留量方法，并对该方法进行了验证。

1试剂与仪器

1.1试剂

甲醇（色谱级，德国默克）；硫酸二甲酯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20190612，纯度：99.5%）；硫酸氢氯吡格雷（江苏联环药业股份有限公司自制产品，批号：LB-20160601）；分子筛（北京百灵威科技有限公司）

1.2仪器

气相-质谱联用仪（Agilent 6890N-7975C）；色谱工作站（MSD ChemStation）； 电子天平（岛津AUW 120.D，ALC-210.4）

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷为填料的毛细管柱（30m*0.25mm*0.25μm）；进样口温度为200℃；载气为氦气，流速为1.0mL/min；升温程序为初始温度60℃保持2min，以6℃/min升至80℃，再以40℃/min升至300℃，保持20min；采用分流进样模式；GC-MS接口温度为280℃；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；扫描离子为95；扫描模式为SIM模式；溶剂延迟3min；进样量为2μL。

2.2溶液的制备

对照品溶液：取适量硫酸二甲酯，精密称定，加甲醇溶解并制成每1mL中约含硫酸二甲酯0.5μg的溶液作为对照品溶液；

供试品溶液：准确称取0.33g硫酸氢氯吡格雷至10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，再加入适量分子筛除水后得到空白供试品溶液；

根据硫酸二甲酯的理化性质和试验经验，硫酸二甲酯在常温下容易降解，故所有溶液配制完成后均置于0℃以下的环境中保存备用，进样时再取出。

2.3专属性

2.3.1空白溶剂

甲醇

2.3.2空白供试品溶液

取生产得到的硫酸氢氯吡格雷0.33g，精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，再加入适量分子筛除水，作为空白供试品溶液；

2.3.4对照溶液

取适量硫酸二甲酯，精密称定，加甲醇溶解并制成每1mL中含硫酸二甲酯0.5μg的溶液作为对照品溶液；

分别取上述溶液各2μL直接进样，记录色谱图，图1为空白供试品与对照溶液重叠图；图2中图2a为空白试剂的色谱图，图2b为空白供试品的测试色谱图，图2c为对照溶液测试色谱图。由图可知，空白溶剂不干扰硫酸二甲酯出峰；空白供试品溶液不干扰硫酸二甲酯出峰。综上所述，该方法的专属性良好。

图1空白供试品与对照溶液色谱图重叠图

图2 2a为空白溶剂色谱图；2b为空白供试品色谱图

图2c为对照溶液测试色谱图

2.4线性

分别取硫酸二甲酯适量，精密称定，分别用甲醇定量稀释制成每1mL中含有硫酸二甲酯5.0μg的溶液，作为线性储备液。精密量取上述线性储备液，逐级稀释，配制成一系列浓度的线性标准溶液。精密量取各线性浓度溶液2μL直接进样，记录色谱图，结果如表1所示。结果表明，硫酸二甲酯浓度在0.02712~2.712μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.9999。

表1线性范围考察试验结果

2.5进样精密度

精密量取对照品溶液2μL直接进样，记录色谱图，计算其峰面积的相对标准偏差。结果显示，对照品连续进样6针，硫酸二甲酯峰面积的RSD不大于5%，表明在该色谱条件下，系统的进样精密度良好。

2.6定量限及检测限

取硫酸二甲酯的储备液，加甲醇逐级定量稀释配制成定量限浓度（S/N约为10）溶液和检测限浓度（S/N约为3）溶液。定量限和检测限各测定一次。具体结果如表4所示。由表2可知，硫酸二甲酯的定量限、检测限浓度均远低于限度浓度，说明此色谱条件能将样品中微量的硫酸二甲酯有效检出，方法灵敏度较高。

表2 定量限及检测限测试结果

2.7回收率

对照品储备液：取适量硫酸二甲酯，精密称定，加甲醇溶解并制成每1mL中含硫酸二甲酯5.0μg的溶液作为对照品储备液。

对照品溶液：取对照品储备液适量，用甲醇稀释配制成每1mL中含硫酸二甲酯0.5μg的溶液作为对照品溶液。

供试品储备液：取生产得到的硫酸氢氯吡格雷适量，精密称定，用甲醇溶解并配制成每1mL中含硫酸氢氯吡格雷66.7mg的溶液，再加入适量分子筛除水后作为供试品储备液。

空白供试品溶液：取供试品储备液适量，用甲醇稀释配制成每1mL中含硫酸氢氯吡格雷33.3mg的溶液，作为空白供试品溶液。

回收率溶液：取供试品储备液和对照品储备液适量，至同一量瓶中，用甲醇稀释，配制成每1mL中含硫酸氢氯吡格雷33.3mg、硫酸二甲酯0.5μg的溶液，作为100%回收率溶液，平行配制3份。同法配制50%回收率溶液（每1mL中含硫酸氢氯吡格雷33.3mg、硫酸二甲酯0.25μg）和150%回收率溶液（每1mL中含硫酸氢氯吡格雷33.3mg、硫酸二甲酯0.75μg）各三份。分别取上述溶液2μL进样，记录色谱图，结果记录如表3所示。试验结果表明，本方法中硫酸二甲酯的回收率在82.9%~95.2%之间，RSD（n=9）小于10%，符合规定。

表3回收率试验

2.8重复性试验

采用加标样品进行试验，加标的浓度及溶液制备的方法均同回收率试验项下100%的浓度水平，平行制备6份样品。分别取上述溶液2μL进样，记录色谱图，按外标法进行计算，结果见表4所示。实验结果显示，6份加标溶液中硫酸二甲酯的检出量基本一致，RSD小于5%，说明本方法的重复性良好。

表4 重复性试验结果

2.9对照品溶液稳定性

取硫酸二甲酯适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每1mL中含有硫酸二甲酯0.5μg的溶液作为对照品溶液，将对照品溶液置于0℃以下的环境中保存，取不同时间点对照品溶液2μL进样，记录色谱图。由结果可知，硫酸二甲酯在6h（360min）内峰面积RSD小于5%，故对照品溶液在0℃以下保存6h内稳定。

3讨论与结论

本研究建立气相-质谱联用检测硫酸氢氯吡格雷中的硫酸二甲酯残留量。方法检测灵敏度高，且硫酸二甲酯的线性范围在限度浓度的5%~500%范围内线性关系良好；根据回收率、重复性及进样精密度试验可知该方法的精密度与准确度均良好；对照品溶液在0℃以下放置6h内溶液稳定性良好。

因此该方法适用于硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯含量检测，保障产品质量。

参考文献

[1] 袁静. 氯吡格雷的药理学、临床疗效和耐受性[J]. 中国临床药学杂志, 1999, 8(4): 264-265。

[2] 史迎杰，温静，赵新颖，等. 气相色谱-质谱法测定药品中残留的硫酸二甲酯和硫酸二乙酯[C]//环渤海色质谱绿色新技术. 辽宁:第四届环渤海色谱质谱学术报告会， 2016： 393-396。

[3] Candidate List of substances of very high concern for Authorisation [EB/OL]. [2012-12-19]. https://echa.europa.eu/substance-information/-/substanceinfo/100.000.963。

[4] ICH Harmonised Guidline. Assement and Control of  DNA Reactive(Mutagenic) Impupities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk M7(R1)[S].[2017-3-31]: 84-87。

[5] ICH M7(R1)Current Step 2 version．Addendum to ICH M7：Assessment and control of DNA reactive(mutagenic)impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk[S]．2015：2-7。

[6] 裴德君．气相色谱．质谱联用法测定纺织品中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯[J]．分析实验室，2015，34(I)：3l-34。

[7] 林君峰，麦志喜，王成云，等．超声萃取-气相色谱-串联质谱法测定纺织品中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的残留量[J]．福建分析测试，2017，26(1)：7-12。