简介:目的:克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果:cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论:成功克隆和表达了COPS3cDNA。
简介:为研究黄金茶出芽早的分子机制,本研究采用SMART-RACE技术,获得了与解除休眠相关的转录因子CsDAM2基因的全长eDNA序列,并进一步对该氨基酸序列进行了生物信息学分析。研究发现CsDAM2基因全长为1386bp,序列分析表明,该序列含有一个完整的编码区,大小为657bp,编码区GC含量为50.45%。此编码区可以编码分子量为24.86kD的亲水性蛋白,该蛋白由218个氨基酸组成,理论等电点(pI)为8.96。黄金茶CsDAM2蛋白有11个磷酸化位点,属跨膜蛋白,与毛白杨DAM3的相似性为71%,与已登录茶树MADS.box蛋白的一致性为35%。本研究为进一步揭示黄金茶春芽萌发早的分子机制提供了理论依据。
简介:胰岛素样生长因子2(insuline-likegrowthfactors2,IGF2)在脊椎动物的生长和发育中具有十分重要的作用.本研究利用分子克隆技术,从泰国斗鱼(Bettasplendens)雄鱼的肝脏组织中克隆鉴定出泰国斗鱼IGF2cDNA开放阅读框序列全长989bp,其中开放阅读框为629bp,共编码209个氨基酸残基.通过多重序列比对分析,泰国斗鱼IGF2的氨基酸序列与其他鱼类的IGF2具有较高的同源性,显示出序列的保守性.此外,利用RT-PCR检测IGF2在泰国斗鱼雌雄个体不同组织中的表达,结果表明IGF2在泰国斗鱼各组织中的表达具有显著的组织表达差异性,同样也存在着性别表达差异性.本研究结果为深入研究泰国斗鱼的igf2基因在生长发育中的调控机理提供研究基础.
简介:硬酯酰辅酶A脱氢酶(Stearoyl-CoADesaturase,SCD)是参与脂肪酸脱氢反应的限速酶和关键酶,此酶编码基因SCD对增加膜磷脂的不饱和脂肪酸成分,提高细胞膜在低温下的流动性发挥重要作用,可能是抗寒过程中的关键基因成员。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplificationsofcDNAEnds,RACE)克隆了鲤(Cyprinuscarpio)脑组织CcSCD基因的全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在低温(6℃)和常温(23℃)条件下的转录表达差异,对其蛋白编码序列的结构和功能进行了预测分析。结果显示,CcSCD基因cDNA全长2618bp,包含一个由324个氨基酸残基组成的长度为975bp的阅读框(ORF);蛋白分子进化树显示鲤的SCD和草鱼(Ctenopharyngodonidella)的SCD蛋白同源性最高,相似性达88%;实时荧光定量结果表明,低温刺激下(6℃),CcSCD基因表达水平是常温条件下(23℃)的13.9倍,差异非常显著(P〈0.01)。本研究旨在为今后构建表达载体,通过遗传操作等研究手段鉴定其抗寒功能奠定基础。
简介:P16ink4是CDK抑制蛋白,参与调控细胞G1期至S期的转换。目前发现P16`(ink4)基因损伤与多种肿瘤的发生、发展有关,可能是功能上非常重要的抑癌基因。为了研究该基因的功能,以及突变对该基因功能的影响,本文应用RT-PCR方法,从Hela细胞中克隆了P16ink4cDNA。扩增得到556bp片段(包括引物两端酶切位点的16bp)克隆于M13载体,测定了其DNA序列。该序列包括了P16ink4cDNA编码区全部471bp,以及3’端69bp序列。表明P16ink4cDNA已成功地得到克隆。
简介:背景:肝纤维化病程迁延且药物治疗效果不理想,基因治疗将成为这一领域研究的热点.研究显示白细胞介素(IL)-10对肝脏具有保护作用,可阻止肝纤维化的发生、发展.目的:克隆并鉴定Sprague-Dawley(SD)大鼠IL-10基因的全长cDNA,为进一步构建大鼠IL-10腺病毒重组子和肝纤维化基因治疗的研究奠定基础.方法:自行设计IL-10上下游引物,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从SD大鼠脾脏单核细胞中扩增编码大鼠成熟IL-10肽链的cDNA片断.扩增产物与连接载体pMD-18T连接后转化感受态菌DH5α,构建重组载体pMD-18T-IL-10.结果:以SD大鼠脾脏单核细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出大小为540bp的大鼠IL-10cDNA片断.所构建的重组质粒经HindⅢ+KpnⅠ双酶切显示含有目的基因片段,测序结果证实扩增出的DNA片断与大鼠IL-10基因序列相符,表明编码区无基因突变.结论:成功地克隆了大鼠IL-10基因的全长cDNA,并构建了重组载体pMD-18T-IL-10.
简介:摘要目的应用cDNA分子克隆测序方法,鉴定中国南方汉族1个KIR3DL3新等位基因。方法采集1例KIR3DL3基因测序结果异常的无偿志愿捐血者的外周血样,提取mRNA并逆转录为cDNA。设计1对具有KIR3DL3基因特异性的PCR引物对cDNA进行扩增,扩增产物纯化后进行分子克隆测序。结果经分子克隆测序,检出1个正常的KIR3DL3*00802等位基因和1个KIR3DL3*064新变异等位基因。KIR3DL3*064与KIR3DL3*00601等位基因的序列最为接近,仅有编码区存在nt1184 C>T错义变异,导致第9外显子中的第374密码子由ACT变为ATT,所编码的苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile)。该等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为KIR3DL3*064。结论cDNA分子克隆测序法能够鉴别常规测序分型中的异常结果,可用于鉴定KIR3DL3新等位基因。
简介:紫外线B(UV-B)对于植物生长发育具有重要调节作用,其中UVRESISTANCELOCUS8蛋白作为UV-B的光受体在植物响应UV-B过程中起关键作用。草莓是一种重要的经济果树,目前关于草莓的UV-B光受体报道较少。为研究草莓中UV-B受体蛋白,本研究采用同源克隆的方法获得‘丰香’草莓中编码UV-B光受体蛋白的cDNA序列,进行了生物信息学的分析并构建了原核生物表达载体pET32a-UVR8,利用中心点响应面法优化了重组蛋白的诱导条件(包括诱导温度,IPTG浓度,菌液浓度和诱导时间)。结果表明:克隆得到了编码草莓UVR8蛋白的全长cDNA序列,命名为FaUVR8,生物信息学分析表明该序列长1317bp,编码438个氨基酸,预测分子量为47.28kD,等电点pI为5.85,重建蛋白质三维结构表明该蛋白包含7个β-片状螺旋结构;原核表达得到69.7kD的融合蛋白,对四个诱导条件优化表明将工程菌培养至菌液OD600=0.7,加入浓度为0.55mmol/L的IPTG,在27.72℃下诱导9h,可获得最大量重组蛋白79μg/mL。研究结果可为后期寻找与FaUVR8蛋白互作的下游蛋白,以及进一步开展其功能研究提供参考。
简介:1997年4月,英国科学家宣布用克隆技术培育出一只绵羊“多莉”。一时间,“克隆”成为20世纪末惊世骇俗的遗传科技。与此同时,围绕克隆技术的间谍窃密、微机复制窃密活动也就相伴而生了。继英国克隆出绵羊后,美国和欧洲也纷纷克隆猪、牛等。在克隆研究中,植入一头胚胎猪或一头胚胎牛细胞中的究竟是哪一种基因,是一个技术秘密,有关公司都守口如瓶。早在几年前,我国(下转第45页)(上接第37页)有关部门便利用克隆技术成功地培育了牛、猪、山羊等动物。国外克隆实验研究机构与间谍机构联手,伺机窃取我克隆机密。我国克隆机密存储于电脑克隆软盘中,国家保密机构为它制定了严格的保密防范措施,反间谍机关则严密注视国际上克隆技术